烟草抗青枯、黑胫病益生菌剂研制与应用2.ppt

1、烟草抗青枯、黑胫病益生菌剂研制与应用,湖南省烟草公司郴州市公司 河南工程学院资源与环境学院 郴州市公司桂阳县分公司,1.项目实施的背景,1.1 青枯病、黑胫病是烟草生产上的毁灭性病害。,湘西土样中青枯菌含量较大，永州次之，郴州相对较少，土壤中青枯菌含量与青枯病发生的严重程度呈正相关，其中加青枯菌拮抗菌肥土壤中的含菌量明显少于未加菌肥土壤 杜桂萍，周建国，烟草青枯病菌的田间快速检测，湖南农业大学学报. 2010,36(2):192-195.,1.2 对青枯病的防治尚无理想药剂和抗病品种。,规模化发展、集约化经营,烟草连作,病原积累,病害发生造成损失,易感品种,合成农药 的长期使用,活性化合物积累

2、 农药残留 非靶标毒性 病原菌耐药性逐渐增强 烟草及其制品安全性,烟草可持续发展受到影响,1.3 化学农药使用的长期影响。,1.4 湖南省郴州市烟草种植面临的主要问题。,目前最突出的问题是根茎病害和叶部病害； 根茎病害发生规律复杂、危害严重、难以控制。 烟草青枯病和黑胫病是烟草的系统性、突发性和流行性病害，面积和危害程度都在扩大，已经成为制约我省郴州市烟叶生产可持续发展的重要的因素。,文献检索后发现,有关烟草青枯病害的报道有162篇论文 王岩等以硫酸庆大霉素为诱变剂，通过浓度梯度平板法筛选出拮抗效果与T5菌株类似的抗性突变菌株T5-1，该菌遗传稳定性较好。以牛粪、玉米秸秆为原料生产有机肥，当堆

3、温达到50 以上后保温2周，然后降温至40时接入T5-1菌株，40 下培养3 d，可得到拮抗菌和嗜温菌浓度均为1012cfu/g (干基)的高密度堆肥产品。 大田试验结果表明，该有机肥对烟草青枯病具有一定的防治效果，第一年有机肥施用量较小，效果不显著；第二年连续施用有机肥且加大施用量，抗病效果显著增加，其中生物有机肥作基肥施用效果最好，青枯病的发病率较对照降低了50.65 ，病情指数降低了71.09。,有关烟草黑胫病害的报道有179篇论文。 方敦煌等报道生防菌GP13不同施用时期防治效果表明，生防菌对烟草黑胫病的防治效果在40.1-90.5 ，3个时期以成活后施用，防治效果较好，移栽期效果稍差

4、，假植期防效相对较差。500倍生防菌菌剂的防效与对照药剂相当，防效为42.6-94.5。,未见通过直接对病原菌抗生素标记，不经过平板拮抗，直接进行土壤菌株对抗筛选的研究报道。,二、研究目标和主要研究内容,研究目标 1. 通过室内及大田试验，建立恰当的抑制黑胫病、青枯病益生菌剂筛选方法，筛选出20-35抑制土壤青枯病、黑胫病病源菌在烟田内扩繁的益生细菌、芽孢杆菌。 2. 构建抑制青枯病、黑胫病病源菌数量的益生菌库，实现对根茎病害的多元化控制。 3. 研究益生菌剂的生产、保存、使用的关键技术，对连作烟田的失衡微生物系进行原位修复； 4. 构建青枯病和黑胫病的模式研究系统，实现对根茎病害的可持续控制

5、。,主要研究内容,1 烟草根际、叶际优势微生物菌库的建立。以桂阳代表性的植烟土壤为对象，可培养方法在实验室中对优势微生物进行分离纯化，构建一个丰富的根际优势微生物菌库群，其目的是为构建菌库提供优质的菌种资源。 2. 实验室模拟并研究不同微生物在灭菌土壤中的定植能力，筛选出模拟大田情况下，在可变环境中定植能力均较好的微生物，从而构建益生菌库。 3. 研究菌剂种类和用量对不同病害发病情况降低程度，确定较为有效的田间菌剂使用浓度，使用条件，与栽培技术的配套情况，评估菌剂的适应能力，为菌剂使用提供理论依据。,4.益生菌剂对土壤微生态的影响及抗病机理研究 （1）菌剂对土壤中有效N、P、K含量变化影响研究

6、 （2）菌剂对土壤微生物群落结构影响研究 5.确定菌株的生产参数 研究菌剂规模化生产关键技术和技术参数:以工业化生产为前提，研究不同发酵工艺菌剂中活菌收获率，降低生产成本，确定生产环节的关键技术参数，进行中试生产研究，并对产品不同保存情况下菌剂活力进行研究，确定关键技术，为菌株产业化生产销售提供技术储备。,三、技术关键与创新点,1、技术关键 （1）建立具有桂阳烟区土壤代表性的能够在烟草根际、叶际定植且具有降低病原微生物侵染能力的微生物菌库，并从中筛选出具有田间使用效果的菌株。 （2）大田实验中该菌株能够在烟草根际、叶际与病原菌的生态位竞争中占有优势，可以在大田中繁殖、持久性生存，稳定，具有可持

7、续性。 （3）确定菌剂的生产培养关键技术，菌剂保存条件，如是固态菌剂，确定填充剂成分，掌握不同环境条件下菌剂保存时间与菌剂活菌数的关系。,2、创新点 本项目从病原菌、寄主植物、发病土壤三要素出发，直接利用抗生素标记青枯病原菌、益生拮抗菌，基于生态位理论研究在土壤中病原菌、益生菌群的变化，及植株感病情况情况，构建益生菌库，最终实现对烟草病害的生物多元化控制方法；,四、研究方法与技术路线,1、主要的试验研究方法 （1）采集桂阳烟区烟草不同生长时期根际土壤、叶际样品，调查烟草根际微生物群落结构，并分离纯化烟草优势细菌。以桂阳烟区种植的烟草植株为研究对象，不同生长阶段，取烟草根际土壤、叶片，采用土壤溶

8、液培养基、营养肉汤培养基、PDA培养基培养等方法，结合分子克隆技术研究烟草根际、叶际微生物多样性，分离代表性优势微生物。,（2）实验室烟草根际、叶际益生微生物菌库的建立。 土壤优势细菌分别接种桂阳烟区代表性灭菌土壤，设置不同土壤温度、湿度、营养类型，病害接种量等变化，筛选对病害微生物生长繁殖抑制且不同情况下均表现较强定植能力的微生物，采用分子鉴定方法鉴定菌种后构建菌库。,（3）盆栽试验选择优良菌株 在初步筛选的基础上，缩小筛选范围，并对筛选菌株进行抗生素选择性标记（选择与出发菌株生长型一致的菌株），消毒烟苗栽培至桂阳烟区代表性灭菌土壤，抗生素标记菌株灌根或喷洒至叶际后，接种病原微生物（青枯、黑

9、胫等病菌），设置温、湿度梯度、菌剂使用浓度等环境变量，研究烟苗病情指数，表现优良的作为菌剂备选。,（4）大田试验选择菌剂配方 根据实验室盆栽结果，多点选择合适的烟田，跟踪菌剂在烟草生长期内在根际、叶际的定植规律，研究对烟草品质的影响。实验结果表现较好的菌剂作为生产备选。,（5）确定菌种生产关键技术，开展中试研究，确定产品剂型、存放条件。 与企业合作，研究菌剂发酵生产关键技术和技术参数，降低成本，以工业化生产为前提，研究所选用基质配方的规模化生产关键技术，并确定生产各环节的相应技术参数，为功能生物有机肥的研发提供支撑。研究液态、固态菌剂的保存方法及相应保存时间，活菌或数量变化趋势，研究不同保存环

10、境条件（光、温度、pH、含水量等）对菌剂活力影响，优化得出适宜的生产、保存及运输条件。,（6）研究菌剂在土壤中迁移、繁殖规律，对土壤微生态的影响。 抗生素标记菌剂分别对田间烟苗采用灌根等接种技术，研究在烟草根际、叶际、维管束定植规律，PCR-DGGE、克隆文库技术、T-RFLP、Biolog等技术研究菌剂对土壤微生物生态影响，阐明菌剂的施用对烟草土传病害病原菌的拮抗作用及抑制病原菌生长的机理。,2、技术路线,五、预期达到的目标,1、成果形式 （1）构建适应桂阳烟区特点的益生微生物菌库1个，菌库容量高于20种微生物。 （2）产品：田间证明有效，达到申请国家微生物肥料产品标准的微生物菌剂产品1-2

11、个，并已通过中试生产。 （3）论文 2-4篇。 （4）专利 1-2项。 （5）施用项目研发的菌剂后，植烟土壤微生态改良、土传病害降低，发病指数比对照烟田病情指数降低20%。,2、经济指标： 预计项目结束后，每亩烟草施用菌剂10 公斤，按3元/公斤，每年推广20万亩，控制生产成本不高于0.7元/公斤，此项目5年内新增产值就达 300万元之多，本项目生产菌剂在防治烟草青枯病、黑胫病的同时，具有防治茄科作物土传病害的潜力，通过在烟草栽培中的示范性应用，将会带来可观的经济效益。,六、具体实施措施,1、建立项目组，以项目的形式实施 郴州市烟草科学研究所、河南工程学院资源与环境工程学院共同牵头，郴州市烟草

12、公司桂阳县分公司，三个单位根据各自特点具体组织实施。 2、在河南工程学院和重庆市烟草研究所建立菌种选育研究平台，进行菌株选育和分析研究。 3、项目组将成立技术组，研发关键技术，引进成熟经验，制定祥尽的技术实施方案。 4、研究、试验、示范、培训、具体实施相结合。,七、项目开展的条件及已经进行的部分工作,（一）项目开展的条件 1、市、县公司的大力支持，烟农的迫切需要。 2、相关文献得成功报道、已有的工作基础可确保项目的可行性。 3、已经组建了具有丰富经验的7人工作团队，项目展开具有具有可靠的硬件配备 4、已有相应的菌剂中试厂家。,（二）已有的工作基础： 1、项目申报单位湖南省烟草公司郴州市公司在从传统烟叶生产向现代烟草农业转变方面，做了许多有益的研究与探索，并取得良好成效，积累了丰富的经验。 。 2、郴州市公司与河南工程学院在2010就开展了针对桂阳县旱田烟草青枯病生物防治的科研工作，连续两年从桂阳仁义石坡、桂阳樟市曹新桥曹溪、桂阳樟市山背、桂阳仁义王泗烟草青枯病发病严重地区取样70个，调查烟草青枯病发病株与未发病株、旱田与水田根际微生物群落种群均一度、种群丰富度，种群类别等指标，并进行跟踪、对比分析，两年中共分离出优势细菌60余株、芽孢杆菌87株，分离出烟草青枯病病原菌5株。,项目组