高华 2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容.ppt

1、2010年版中国药典 生物检定部分修订内容,高华 中国药品生物制品检定所,主要内容,一、药品生物检定概况 二、药品生物检定增修订情况,药品生物检定概况,定义 应用范围 作用,药品生物检定-定义,生物检定法是利用生物体包括整体、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。,药品生物检定,体内测定（in vivo）-以整体动物生物体 体外测定（in bitro

2、）-以离体器官、组织、微生物、酶和细胞（原代细胞、传代细胞）为生物体，利用这些生物体评价药品的生物活性（药效、活力或毒力）,应用范围,药品（生化药品、中药） 生物制品（疫苗、血液制品） 安全性检查,应用范围,对从动物脏器、微生物或体液等提取的，有效成分不够确切，多组分、结构复杂，理化方法不能有效鉴定并具有生物活性的天然生化药物、中药，以及有些生物技术药物，由于空间结构的细微变化，影响药物的活性中心位点，目前质量标准中仍应用生物检定法评估药物的生物活性。 如生化药物：一般是从生物体分离、纯化所得 如肝素钠、鱼精蛋白、促肾上腺皮质激素。 中药：洋地黄制剂、人工麝香、水蛭等。,药品生物检定作用,工艺

3、与方法验证 效价与活性 鉴别,作用工艺及方法验证,对于新生产工艺、新检测方法的改进、变更，往往需要生物检定来验证核对。中、外药典在重组人生长激素（rhGH）重组人胰高血糖素质量标准中明确规定，在生产研发阶段，“生产过程中的产品必须用体内生物检定方法测定其生物效价”，直到生产稳定为止。,作用效价与活性,当采用理化方法测定如HPLC替代胰岛素等原有的生物效价测定法时，仍需作大量的方法比对、相关性研究等工作。,作用效价与活性,定量的测定方法 半定量的测定方法,定量的测定方法,效价（potency）测定是生物检定的主要内容，它是以药理为基础，生物统计为工具，运用特定的实验设计，利用生物体在一定条件下比

4、较供试品与相当于标准品或对照品所产生的特定反应（可测量、量化的生理指标或生物药效或毒力）的一种定量的方法，因而被称为定量药理学。,定量的测定方法,胰岛素 缩宫素 肝素 卵泡刺激素 黄体生成素,升压素 硫酸鱼精蛋白 洋地黄 生长激素 降钙素,半定量的测定方法（活性检查）,当理化测定占主导地位，效价测定一般来讲可以不必精确，可归于活性检查项，采用半定量方法，设定限值，不需精密生物统计，尽可能减少实验动物用量或其他生物体用量；甚至只用于定性的鉴别。例如：新药重组人胰高血糖素类多肽是治疗糖尿病用药，其质量标准中即采用该法（限值为小鼠血糖降低大于20%）进行活性检查。,鉴别,随着对动物保护意识提高，对实

5、验动物减少、替代、优化（3R：Reduction、Replacement、Refinement）的实施，对能用理化测定的药品，生物效价测定逐渐降为鉴别项的定性或半定量测定。 如USP升压素大鼠血压升高法用于鉴别。2010年中国药典缩宫素注射液将子宫收缩法放入鉴别项。,二、附录生物检定方法增修订情况,附录生物检定方法增修订情况 附录增修订主要特点 增修订主要内容,附录生物检定方法增修订情况,附录增修订主要特点,中药质量控制评价模式转变 充分验证 完善提高 充分体现了“3R”原则,附录增修订主要特点,中药质量控制评价模式转变 生物活性引入实现了中药质量标准由单一指标成分定性定量向活性有效成分及生物

6、测定的综合检测。,附录增修订主要特点,充分验证： 遵循科学性、合理性、可操作性，新建或新设立项目必须经不同实验室的共同验证或适用性研究，如注射剂安全性指导原则对方法学的适用性研究；中药生物活性指导原则要求对方法的专属性、准确性、精密度（重复性、中间精密度、重现性）、适用性、科学性进行了研究。,附录增修订主要特点,完善提高 对2010药典一、二部检查法和指导原则进行修订和改进，对影响结果准确性的实验条件提出了要求，如热原检查法、溶血与凝聚、降压物质检查法、过敏试验。,附录增修订主要特点,体现了“3R”原则 如热原检查法取消家兔使用次数和体重上限规定。 中药生物活性指导原则中对动物的使用等。,增修

7、订主要内容,一、热原检查法 二、细菌内毒素检查法 三、异常毒性检查法 四、溶血与凝聚检查法 五、过敏反应检查法 六、降压物质检查法 七、生物检定统计法 八、中药注射剂安全性检查法应用指导原则 九、化药注射剂安全性检查法应用指导原则 十、中药生物活性测定指导原则,热原检查法,定义 2010 版与2005版区别 修订背景 实验用兔灵敏度测试 热原检查适用性研究,热原检查法,定义：本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。,2010 版与2005版区别,*三部仍规定，对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可

8、重复使用1次。,修订背景,、热原实验是一个整体的动物实验，易受许多因素的影响。动物自身的行为、生理、外部环境以及一些实验过程等都可影响结果的准确性。 、对家兔体重取消了上限3.0kg，同时取消家兔使用次数不超过次的规定。,修订背景,、增加了升温达0.6 的家兔应休息2 周以上新要求。 4、实验环境要求更加严格：实验室与饲养室温度相差由不大于 5 改为3 5、强调同组各家兔间温差不大于1 ，对家兔固定方式：宽松。 6、判定标准更加严格：初试的3只家兔体温升高总和低于 1.4 改为低于1.3 ,实验用兔灵敏度测试,每年不定期随机抽取体重和使用次数不同的实验用兔，按热原检查法要求注射EU/kg或10

9、EU/kg内毒素标准品，应得到不符合规定的结果。,热原检查适用性研究,新品种建立热原检查标准时，建议进行适用性研究，在不影响家兔正常生理的前提下，按人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的倍设定限值。（化学药品一般为倍，中药为倍）。,热原检查适用性研究,适用性试验时设三组：限值剂量的供试品组 10EU/kg内毒素组含10EU/kg内毒素的供试品组。 适用性试验判定： 组符合规定， 、组不符合规定表明该品种可建立热原检查项。,二、细菌内毒素检查法,定义 2010版与2005版区别 修订背景 注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则,二、细菌内毒素检查法,定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革

10、兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。,2010版与2005版区别,修订背景,1、细菌内毒素与检查用水除了强调内毒素含量外，还强调应对内毒素试验无干扰作用。 2、强调用干热灭菌法（ 250、30分钟以上）去除内毒素与热原法同步。 3、根据某些药（如抗肿瘤药）用体表面积计算给药量的需要，增加了按体表面积给药时的计算方法。,注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则,本原则依据2010年版药典制订，适用于注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查项目时进行的实验及研究。,需建立内毒素检查项目的品种,质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的

11、品种。 用于注射给药，但未有热原质量控制的品种。 注射用新药需建立热原质量控制的品种。 用于静脉给药的原辅料,建立方法时对鲎试剂及样品的要求,同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂 每个品种至少三批样品（上市品种应检测两个以上生产厂家；新药需检测连续生产的样品）。,确定内毒素限值,一般按公式L=K/M计算。M为人每公斤每小时临床最大用药剂量，依据药品使用说明书，临床用药须知确定。 儿童用药如大于成人，以儿童为准。 为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。 对于体积在100ml以上（包括100ml）的复方静

12、脉输液类品种，内毒素限值一般按0.5EU/ml计。其他单方静脉输液品种除另有规定外也可按用药剂量计算，以EU/mg或EU/U表示。 对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒素检查法的品种可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的是国外药典的限值，应以最新版本药典为准。,干扰实验,建议使用较低灵敏度鲎试剂 (0.5EU/ml或0.25EU/ml),以避免供试品中内毒素的阳性影响。,三. 异常毒性检查法,定义 2010版与2005版区别,三. 异常毒性检查法,定义：本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供

13、试品是否符合规定的一种方法。,三. 异常毒性检查法,异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他原因所导致的毒性反应。 供试品如不合格，表明药品中含有超过正常产品毒性的毒性杂质，临床用药将可能增加急性不良反应。,四. 溶血与凝聚检查法,定义 2010版与2005版区别 修订背景,四. 溶血与凝聚检查法,定义：本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。,修订背景,1、考虑一般家兔容易得到，故将羊血删去；采用兔红细胞悬液； 2、2010版用轻轻倒转3次来观察凝聚，规范了操作； 3、在显微镜下见红细胞凝集为凝聚，

14、简单明确； 4、同时观察1、2号两个平行管与5号管的对比，来判定是否溶血； 5、考虑药物与一次性试管（高分子材料）的相容性，强调用玻璃试管。,五. 过敏反应检查法,定义 2010版与2005版区别 修订背景,五. 过敏反应检查法,定义：本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。,2010 版与2005版区别,修订背景,1、适宜的途径考虑对腹腔有刺激性的药物不适宜腹腔注射； 2、强调同一只动物上； 3、增加部分严重的反应指标。,六. 降压物质检查法,定义 2010 版与2005版区别 修订背

15、景,六. 降压物质检查法,定义：本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定,2010 版与2005版区别,2010 版与2005版区别,修订背景,1、强调对照品的降压活性要符合要求 2、强调猫的正常血压范围为13.320.0kPa 3、强调每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行，而不强调要35分钟之内。,七. 生物检定统计法,定义：生物检定统计法主要叙述的是应用生物检定时必须注意的基本原则、一般要求、实验设计及统计方法。,2010 版与2005版区别,2010 版与2005版区别,12、对结果不均一时进行了举例：如胰岛素测定结

16、果不均一时计算表及计算方法,修订背景,1、生物检定法的概念 2、可信限率的定义及公式 3、（42）、（43）公式修订 4、Sm2 (各次实验差方)及W(校正权重)的定义 5、合并计算时lgPT,八. 中药注射剂安全性检查法 应用指导原则,八. 中药注射剂安全性检查法应用指导原则,中药安全性检查项目的设定 安全性检查方法和检查限值确定,八. 中药注射剂安全性检查法应用指导原则,本指导原则为中药注射剂临床使用的安全性和制剂质量可控性而定。 中药注射剂安全性检查包括：热原（或细菌内毒素）、异常毒性、降压物质、过敏反应物质、溶血与凝聚等项。 根据处方、工艺、用法及用量等设定相应检查项目 进行适用性研究

17、。,（一）中药安全性检查项目的设定,静脉用注射剂：应设热原（或细菌内毒素）、异常毒性、过敏反应、溶血与凝聚等安全性检查项，必要时考虑降压物质检查项。（功能主治中具有与升压相关内容的注射剂除外） 中药注射剂中致热成分复杂，可能干扰细菌内毒素检查，一般首选热原检查项，如该药本身具有清热的药理作用或对家兔有毒性反应，也可选择细菌内毒素检查项。 肌内注射用注射剂： 应设异常毒性、过敏反应等检查项。,（二）安全性检查方法和检查限值确定,方法适用性（设定限值前研究） 确定限值 应进行三批以上供试品的检查验证,1.热原-细菌内毒素检查,方法适用性（设定限值前研究） 热原检查应做适用性研究，求得对家兔无毒性反

18、应、不影响正常体温和无解热作用的剂量。 细菌内毒素检查应进行干扰试验，求得 最大无干扰浓度。 检查方法 参照热原检查法（附录 A）或细菌内毒素检查法（附录 D）。 品种项下可以增加稀释浓度、调节pH和渗透压或缓慢注射等排除干扰或影响的特殊规定。,设定限值-热原检查,限值根据临床一小时内最大用药剂量计算。 热原检查限值可参照临床剂量计算，一般为人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的35倍， 供试品注射体积每公斤体重一般不少于0.5mL，不超过10mL。 限值剂量应不影响正常体温。,设定限值-内毒素检查,限值根据临床一小时内最大用药剂量计算 内毒素检查限值按规定要求计算， 由于药物和适应症 (如抗感

19、染、抗肿瘤、心血管药等急重病症用药、儿童老人用药、复合用药、大输液等) 的不同，限值可适当严格，至计算值的1/31/2，以保证安全用药。 细菌内毒素测定浓度应无干扰反应。,2.异常毒性检查,方法适用性（设定限值前研究） 可参考文献数据，并经单次静脉注射给药毒性试验确定该注射剂的急性毒性数据（LD50或LD1及其可信限）。 可由多个实验室或多种来源动物试验求得LD50和LD1数据。 注射速度0.1ml/秒，观察时间为72小时。 如其它给药途径或延长观察时间应进行相应途径或相应观察时间的急性毒性试验。 检查方法 参照异常毒性检查法（附录 E ）。 对动物、给药途径和给药次数 、观察指标和时间等，方

20、法和限值有特殊要求时，可在品种项下另作规定。,设定限值,限值应低于该注射剂本身毒性的最低致死剂量 考虑到实验室间差异、动物反应差异和制剂的差异，建议 限值至少应小于LD1可信限下限的1/3(建议采用1/31/6)， 如难以计算最低致死量，可采用LD50可信限下限的1/4 (建议采用1/41/8)。 如半数致死量与临床体重剂量之比小于20，可采用LD50可信限下限的1/4或LD1可信限下限的1/3。 静脉注射最大剂量0.8ml/20g仍未见毒性反应或死亡，可以此作为检查限值。,3.降压物质检查,方法适用性（设定限值前研究） 供试品按一定注射速度静脉注射不同剂量，观察供试品对猫血压反应的剂量反应关

21、系。 供试品与对照品注射体积应相同，通常为0.21ml/kg，求得供试品降压物质检查符合规定的最大剂量（最大无降压反应剂量）。 检查方法 参照降压物质检查法（附录 F）。,设定限值,临床单次用药剂量的1/55倍作为降压反应物质检查剂量限值，急重病症用药尽可能采用高限。 特殊情况下，如供试品有一定降压作用，则可按最大无降压反应剂量的1/2-1/4作为限值剂量。 供试品原液静脉注射1ml/kg剂量未见降压反应，该剂量可作为给药限值,4. 过敏反应检查,方法适用性（设定限值前研究） 测定供试品对豚鼠腹腔 (或皮下)和静脉给药的无毒性反应剂量。 可采用注射剂的半成品原辅料进行致敏和激发研究，确定致敏方

22、式和次数 在首次给药后14、21、28天中选择最佳激发时间。 检查方法 参照过敏反应检查法（附录 G）。,设定限值,致敏和激发剂量应小于该途径的急性毒性反应剂量, 适当参考临床剂量 一般激发剂量大于致敏剂量。 常用腹腔或鼠鼷部皮下注射途径致敏，每次每只0.5ml, 每只1ml静脉注射激发。 如致敏剂量较小，可适当增加致敏次数，方法和限值的特殊要求应在品种项下规定。,5.溶血与凝聚检查,方法适用性（设定限值前研究） 对注射剂原液和稀释液进行溶血与凝聚实验研究, 指标除目测外，可增加比色法和显微镜下红细胞计数方法, 确定无溶血和或凝聚的最大浓度 检查方法 参照溶血与凝聚检查法（附录 H）。,设定限

23、值,以无溶血和凝聚的最大浓度的1/2作为限值浓度 一般应高于临床最大使用浓度。,修订背景,1、增加了中药安全性检查项目的设定原则。 2、增加了限制前研究（即方法适用性研究），使方法更具科学性、可操作性。 3、安全性检查法内容省略，检查限值设定更加具体明确。 4、家兔热原检查法检查限值由人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的1-3倍修改为3-5倍。,九. 化学药品注射剂安全性检查法 应用指导原则,化学药品注射剂安全性检查法 应用指导原则,化学药品（包括抗生素、生化药品）安全性检查项目的设定 安全性检查方法和检查限值确定 化药与中药注射剂安全性检查法应用指导原则的异同点,化学药品注射剂安全性检查法

24、应用指导原则,本指导原则为化学药品注射剂临床使用的安全性和制剂质量可控性而定。 化学药注射剂安全性检查包括异常毒性、细菌内毒素（或热原）、降压物质（或组胺物质）、过敏反应等项。 根据处方、工艺、用法及用量等设定相应的检查项目 进行适用性研究。,（一）化学药品（包括抗生素、生化药品）安全性检查项目的设定,1、静脉用注射剂 应设细菌内毒素（或热原）检查项。 所用原料系动物来源或微生物发酵液提取物，组分结构不清晰或有可能污染毒性杂质，且又缺乏有效的理化分析方法的静脉用注射剂，应考虑设立异常毒性检查项。,安全性检查项目的设定,1、静脉用注射剂 所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时,组分结构不清晰，且

25、有可能污染异源蛋白或未知过敏反应物质的静脉用注射剂，如缺乏相关的理化分析方法且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应检查项。 所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时, 组分结构不清晰或有可能污染组胺、类组胺样降血压物质的静脉用注射剂，应考虑设立降压物质或组胺类物质检查项。,安全性检查项目的设定,2、肌内注射用注射剂 所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时, 组分结构不清晰或有可能污染毒性杂质，且又缺乏有效的理化分析方法的肌内注射用注射剂，应考虑设立异常毒性检查项。,安全性检查项目的设定,2、肌内注射用注射剂 所用原料系动物来源或微生物发酵提取物时, 组分结构不清晰或有可能污染异源蛋白或未知过敏反

26、应物质的肌内注射用注射剂，如缺乏相关理化分析方法且临床发现过敏反应，应考虑设立过敏反应检查项。 临床用药剂量较大，生产工艺易污染细菌内毒素的肌内注射用注射剂，应考虑设细菌内毒素检查项,安全性检查项目的设定,3、特殊途径的注射剂 椎管内、腹腔、眼内等特殊途径的注射剂，其安全性检查项目一般应符合静脉用注射剂的要求， 必要时增加其它安全性检查项目，如刺激性检查、细胞毒性检查。,安全性检查项目的设定,4、注射剂辅料 注射剂辅料使用面广，用量大，来源复杂，与药品的安全性直接相关。 在质量控制中，应根据辅料来源、性质、用途、用法用量，配合理化分析方法，设立必要的安全性检查项目。,安全性检查项目的设定,5、

27、其它 原料和生产工艺特殊的注射剂必要时应增加特殊的安全性检查项目，如病毒检查、细胞毒性检查等。,（二）安全性检查方法和检查限值确定 -组胺检查法,定义：本法系将一定浓度的供试品和组胺对照品分别观察出现的收缩反应幅度并加以比较，以判定供试品是否符合规定的一种方法。 不合格供试品表明含有组胺和类组胺物质，在临床上可能引起血压下降和类似过敏反应等严重的不良反应。,（二）安全性检查方法和检查限值确定 -组胺检查法,检查方法 参照本附录“附 组胺类物质检查法” 设定限值前研究 在确定限值前，应考察供试品对组胺对照品引起的离体豚鼠回肠收缩反应的干扰（抑制或增强），求得最大无收缩干扰浓度。 若供试品的处方、

28、生产工艺等任何有可能影响试验结果的条件发生改变时，需重新进行干扰试验。,组胺检查法,干扰试验 按组胺类物质检查法，依下列顺序准确注入供试品稀释液加对照品稀释液低剂量、对照品稀释液低剂量、供试品稀释液加对照品稀释液高剂量、对照品稀释液高剂量（dSL+T、dSL 、dSH+T、dSH ），重复一次，如dSL+T及dSH+T所致的反应值与dSL及dSH所致的反应值基本一致，可认为供试品不干扰组胺物质检查；同时应进行本法与降压物质检查法符合性的研究。否则该品种不适合设立组胺物质检查项，建议设立降压物质检查项。,组胺检查法,限值确定 除特殊要求外，原则上与降压物质检查限值一致，以临床单次用药剂量的1/5

29、5倍量和每千克体重0.1g组胺剂量计算注射剂含组胺类物质检查限值，其计算公式为：限值L=K/M，其中K值为人每千克体重接受的组胺量（0.1g/kg），M为降压物质检查限值（mg/kg、ml/kg、IU/kg）。供试品剂量应低于最大无收缩干扰剂量。抗肿瘤药、心血管病药等急重病症用药应采用高限。,组胺类物质检查法,定义 本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起豚鼠离体回肠收缩的程度，以判定供试品中含组胺类物质的限度是否符合规定。,增订背景,1降压物质检查法使用的动物为猫，现在猫来源复杂、而且难以得到，动物数量、质量都难以保证。因此使用组胺检查法作为体外替代方法。,增订背景,2许多中药注射剂品种

30、在做降压物质检查时，存在一过性降压现象，如清开灵注射液、复方苦参注射液等，但在临床使用时并不存在降压现象； 还有一些活血化瘀类中药注射剂品种如红花注射液，丹参注射液，红花黄色素注射液等，本身具有扩张血管的作用，在做降压物质检查时，在与临床剂量等同的情况下，血压出现大幅度下降的情况。究其原因，是中药注射剂的成分复杂，还是其本身扩张血管的作用，尚不清楚。 因此，在中药注射液的安全性评价中是否增加降压物质检查项一直存在争议。,增订过程,组胺检查法是豚鼠离体回肠收缩法在药品检验领域的应用。豚鼠离体回肠收缩法本身是一种成熟的药理实验方法，在基础药理研究领域应用广泛，其作用机制、拮抗剂与激动剂的类型与剂量

31、等基础研究均细致深入。本法在借鉴的基础上，对试验条件、结果判定等进行了明确与改良。,附 组胺检查法,营养液组成特点 A 液：试验当日，取氯化钠160.0g、氯化钾4.0g、氯化钙（按无水物计算）2.0g、氯化镁（按无水物计算）1.0g 与磷酸氢二钠（含12 个结晶水）0.10g，加注射用水700ml 使溶解，再加入注射用水适量，使成1000ml。 B 液：取硫酸阿托品0.5mg、碳酸氢钠1.0g、葡萄糖（含1 个结晶水）0.5g，加适量注射用水使溶解，加A 液50.0ml，混合后加注射用水使成1000ml。B 液应临用前配制，并在24h 内应用。,结果判定方法,如供试品溶液引起回肠收缩： 则分

32、别计算dSL、dT 所致反应的平均值。 若dT 所致反应的均值不大于dSL 所致反应的均值，即判定供试品组胺类物质检查符合规定； 若dT 所致反应的均值大于dSL所致反应的均值，即判定供试品组胺类物质检查不符合规定。,结果判定方法,如供试品不引起回肠收缩： 则在供试品溶液中加入组胺对照品高、低剂量，并按下列次序准确注入dSH、dSL+T、dSH+T、dSL, 重复一次。 若供试品组胺溶液产生的收缩与对应组胺对照液高、低剂量的收缩基本一致，可判定供试品组胺类物质检查符合规定； 若供试品组胺溶液产生的收缩与对应组胺对照液高、低剂量产生的收缩不相符，即减少或无收缩，或不能重复出现，则此检查结果无效，

33、应进行供试品的降压物质检查。,技术要求与注意事项,动物要求 1、实验证实纯种动物对组胺的反应更为灵敏，收缩值高，灵敏度也较为稳定。因此使用纯种动物是保证实验顺利的基础。 2、动物体重应严格控制在250-350g，动物体重过大、过小灵敏度均难以重复。 3、禁食时间对豚鼠的肠道平滑肌功能有直接影响，故动物禁食应控制在24h左右，禁食后未使用的动物近期内不应用于本实验。,技术要求与注意事项,肠管处置 1、剖腹取出回肠一段（选用远端小肠，因为此段最敏感），注意避免因牵拉使回肠受损，肠系膜不必要全部分离，容易损伤肠管，少带一些血管组织，肠管更有活力。 2、新鲜取出的肠管宜立刻浸泡至营养液B中。 3、肠管

34、剪取23cm长，具体长度应依据浴桶高度取舍。,技术要求与注意事项,4、剪取后立即使其在营养中平衡一段时间，并在20分钟内开始给予组胺。 5、离体肠管可以保存于B液中，至2-8冰箱中冷藏，通入氧气，24h内可以使用。冰箱中保存的离体肠管使用时宜挂在浴桶内1h左右后再开始试验。,技术要求与注意事项,预负荷 对于准确记录组胺引起的回肠收缩值十分重要，调零后应预加负荷1g左右，调节使其对收缩的反应最为灵敏。在肠管平衡的过程中，因肠管松弛，预加的负荷值会降低，必要时应调整使其对收缩的反应最为灵敏。但在确定了dSH、dSL后，则不应调整，否则可能引起dSH、dSL的收缩高度改变，失去意义。,技术要求与注意

35、事项,干扰的判断 干扰的判断是试验过程的重要影响因素。试验中有时灵敏度的下降与样品干扰引起的回肠收缩降低难以区分，应静置或冲洗浴筒使灵敏度恢复后重新试验。,技术要求与注意事项,建议先取一段肠管，以组胺对照液10-9、10-8、10-7、10-6g/ml依次给予，观察肠管收缩，以确定所用动物的最佳剂量范围；要注意的是如果组胺对照液的浓度过高，有可能使肠管收缩难以恢复，应更换肠管。,（三）化药与中药注射剂安全性检查法应用指导原则的异同点,1.安全性检查法和检查限值确定中异常毒性检查、细菌内毒素、热原检查、降压物质检查、过敏反应检查两者一致。 2.化学安全性检查项目设定原则中增加了特殊途径的注射剂、

36、注射剂辅料及其它。 3.化学注射剂增加了组胺类物质检查项,而中药注射剂增加了溶血与凝聚检查。,十、中药生物活性测定指导原则,生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。 其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。,概 念,控制中药有效性的一种方法； 方法基础：生物效应； 方法工具：统计学； 目的：控制质量； 分类：定量法生物效价测定法 定性法生物活性限值测定法,背 景,中药的药材来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得中药制剂的质量控制相对困难 中药往往含有多种活性成分和具有多种药理作用，仅仅控制少数成分

37、不能完全控制其质量和反映临床疗效 为了使中药的质量标准能更好地保证每批药品的临床使用安全有效，有必要在现有含量测定的基础上增加生物活性测定，以综合评价其质量。,（一）基本原则,符合药理学研究基本原则 应符合药理学研究随机、对照、重复的基本原则；具备简单、精确特点；判断标准应明确。 体现中医药特点 建立的方法，其测定指标应与该中药的“功能与主治”相一致。 品种选择合理 研究的中药材或中成药应功能主治明确， 优先考虑适应症明确，成分单一的中药注射剂品种，对急重症用药、保护品种应重点进行研究。 方法科学可靠 优先选用生物效价测定法，不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法,体现中医药特

38、色,难度大； 判定指标和中医的“功能主治”如何衔接？ 多功能主治中药指标的选择。,品种选择合理,功能主治明确； 适应症单一； 中药注射剂； 急重症用药； 保护品种； 新药？,方法科学可靠,生物效价法 生物活性限值测定法,（二）基本内容,1、实验条件 试验系选择 供试品选择 标准品或对照品选择,试验系的选择,应与试验原理和测定指标密切相关； 背景资料清楚、影响因素少、检测指标灵敏、成本低廉； 实验动物的要求。 尽可能使用小鼠和大鼠，应遵循“优化、减少、替代”的“3R”原则。,供试品的选择,工艺稳定、质量合格（目前的标准要求）； 饮片应基源清楚； 使用三批供试品（方法学研究时）。,标准品和对照品选

39、择,首选中药标准品； 可考虑化学药作为对照品； 生物效价测定法必须要有标准品测定相对效价；生物活性限值测定法用对照品作为验证。,2、实验设计,设计原理 设计类型 剂量设计 给药途径 给药次数 指标选择,设计原理,所选实验方法的原理应明确； 所选择的检测指标应客观、专属性强； 能够体现供试品的功能与主治或药理作用； 如果选择机理研究也应考虑指标的专属性,设计类型,采用生物效价测定法，应按中国药典二部附录“生物检定统计法”的要求进行实验设计研究； 采用生物活性限值测定法，试验设计可考虑设供试品组、阴性对照组或阳性对照组， 测定方法需建立动物模型时，应考虑设置模型对照组。重现性好的试验，也可以不设或

40、仅在复试时设阳性对照组。,剂量设计,如采用生物效价测定法，供试品和标准品均采用多剂量组试验，并按生物检定的要求进行合理的剂量设计，使不同剂量之间的生物效应有显著性差异。 如采用生物活性限值测定法，建议只设一个限值剂量，限值剂量应以产生生物效应为宜；但在方法学研究时，应采用多剂量试验，充分说明标准中设定限值剂量的依据。,给药途径,一般应与临床用药途径一致。 如采用不同的给药途径，应说明理由。,给药次数,根据药效学研究合理设计给药次数； 可采用多次或单次给药,指标选择,应客观、明确、专属性强； 与“功能主治”基本一致； 功能主治多时应如何选择？ 如何体现与功能主治基本一致？,3、结果与统计,试验结果评价应符合生物统计要求。生物效价测定法应符合中国药典二部附录“生物检定统计法”的要求，根据样品测定结果的变异性决定效价范围和可信限率（FL）限值； 生物活性限值测定法，应对误差控制进行说明，明确试验成立的判定依据，对结果进行统计学分析，并说明具体的统计方法和选择依据。,判定标准,生物效价测定，应按品种的效价范围和可信限率（FL）限值进行结果判断； 生物活性限值测定，应在规定的限值剂量下判定结果； 初试结果有统计学意义者，可判定为符合规定； 初试结果没有统计学意义者，可增加样本数进行一次复试，复试时应增设阳性对照组，复试结果有统计学意义，判定为符合规