第三章 基因工程.ppt

1、基因工程,第一节 基因工程概论,含义 理论依据 基本技术路线 优点,一、基因工程的含义,基因工程是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构建遗传物质的新组合并掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖的技术。 是对DNA大分子上的遗传单元（基因）进行体外操作，把不同来源的基因按照单元设计的蓝图，重新构成新的基因组合（即重组体），再把它引入细胞中，构成具有新的遗传特性的生物。,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世

2、界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉 2004年 人类基因组计划的完成,二、基因工程的理论依据,（一）基因工程的诞生,从20世纪40年代到70年代初基因工程的诞生，其中现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性的作用。,1、理论上的三大发现,20世纪40年代确定了遗传信息的携带者（即基因的分子载体）是DNA（脱氧核糖核酸）而不是蛋白质，从而确定了遗传的物质基础问题。,1944年 Avery 肺炎链球菌的转化试验,20世纪50年代揭示了DN

3、A分子双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。,1953年 watson和crick DNA分子双螺旋结构模型,20世纪50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。,1954年 Crick 中心法则 1961年 monod和Jacob 操纵子学说 1966年 Nireberg等人 密码子,2、技术上的三大发明,DNA分子体外切割和连接技术 基因工程载体技术 DNA分子序列分析及相关技术,手术刀,DNA分子体外切割和连接技术,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,黏合剂,1970年，Smith和Wil

4、cox在流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中分离纯化了第一个限制性核酸内切酶Hind II(又称II类核酸内切酶)。 Boyer实验室又于972年发现了一种能够特异切割GAATTC序列、命名为EcoR I的核酸内切酶。 1970年具有更高连接活性的T4 DNA连接酶也被美国的Khorana实验室发现。 1972年，美国斯坦福大学的科学家应用DNA连接酶将限制性内切酶切开的DNA片段进行连接，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。,基因工程载体技术,由于体外酶切所得的大多数DNA片段不具备自主复制的能力。 为了解决这个问题，从而使DNA片段能够在受体细胞内进行扩增繁

5、殖，科学家们必须将获得的DNA片段通过连接酶的催化准确地连接到一种能自我复制的特定DNA分子上，这些DNA分子就是一些安全高效表达的基因工程载体（vetor）。,从1964年开始，Lederberg着手研究细菌的性因子F质粒。此后，其他质粒相继被发现，如抗药性因子（R质粒)、大肠杆菌素因子(Col质粒)。例如哺乳动物细胞表达载体有病毒载体，如腺病毒、疮疹病毒、牛乳头状瘤病毒等；噬菌体载体。,质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实

6、验编号。质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,DNA分子序列分析及相关技术,DNA序列分析技术 核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术,在1973年以S.Cohen为首的研究小组把两个不同的质粒拼接

7、在一起，组合成一个嵌合质粒，并将此质粒作为基因工程的载体使用，首次获得基因克隆的成功。这年也被定为基因工程诞生的元年。,三、基因工程的基本技术路线,遗传工程（genetic engineering） 基因工程（gene engineering） 基因操作（gene manipulation） 重组DNA技术（recombinant DNA technique） 基因克隆（gene cloning） 分子克隆（molecular cloning）,基本路线,1、获得目的基因 2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3、将重组DN

8、A分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。 4、从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的宿主细胞克隆。 5、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,主要步骤与内容：,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,目 录,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,动植物病毒,表达,四、优点,将外源DNA的新组合引入到一种新的宿主生物中进行繁殖，打破了常规育种难以突破的物种之间的界线，可以

9、使基因在不同生物之间进行转移和表达。 一种确定的DNA小片段能够在新寄生细胞中进行扩增。,第二节 基因工程的工具酶,凡在基因工程中应用的酶统称为工具酶。,限制性核酸内切酶 连接酶 DNA聚合酶,限制性核酸内切酶,是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸水解酶。,Restriction endo-nuclease,性质,核酸内切酶。,原核生物。,即在核酸分子链的内部制造切口的酶。,自我保护作用。,功能,细菌的限制和修饰系统（R/M体系）,来源,I 型限制性内切酶,目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。,限制性内切酶的类型,II 类限制性内切酶,III

10、类限制性内切酶,1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,一、限制性内切酶的命名,用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。,4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。,2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如EcoK, EcoR。,3. 分离序号用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。,二、限制性内切酶的识

11、别特点和切割方式,II型限制性内切酶是一种位点特异性酶，能够识别双链DNA分子中的特异序列，并在特定部位水解双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键，从而造成双链缺口，切断DNA分子。限制性内切酶的识别序列一般为18个核苷酸，这些序列大多呈回文结构。,首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。,II类限制性内切酶,分离的第一个酶是Hind ,EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky

12、 end）或平末端（blunt end）。如：,识别位点处。,（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：, 5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCAG, 3端凸出（如Pst I切点）,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,连接便利,（4）粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末

13、端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。, 补平成平齐末端,凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。, 5末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,识别位点的序列相同的限制性内切酶。,（4）同裂酶（Isoschizomers), 完全同裂酶：,识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。,

14、不完全同裂酶：,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等,（5）同尾酶(Isocaudamers）,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,？,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl ,5-GGAT

15、CT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,Sau 3A,限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。,（6）限制酶的酶活性,如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。,所以一般使用专一的反应缓冲液。, 星号（*）活性,EcoR I和BamH I等都有*活性。,在低盐、高pH（8）时可识别和切割,GAATTA、AAATTC、GAGTTC等,GAATTC,EcoR I：,使用的时候要特别注意！,7,几种常用限制酶识别位点,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1.

16、 DNA的纯度,三、影响限制性内切酶活性的因素,纯化DNA 加大酶的用量 延长保温时间 扩大反应体积（ 20l）,一般采取,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,2. DNA的甲基化程度,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCAGG/CCTGG的C）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。,3. 温度,是影响限制酶活性的重要因素。,4. 缓冲液(Buffer),缓冲液的化学组成,MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇

17、（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。,5. 限制酶酶切反应的终止,从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。,DNA连接酶（ligase),DNA复制一定有断口。,能够将DNA链上彼此相邻的3-羟基（ OH ）和5-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。 只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,DNA ligase的定义,（1）大肠杆菌连接酶,只

18、能连接粘性末端。,（2）T4噬菌体的连接酶,不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。,（1）必须是两条双链DNA。,（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+,连接条件,连接酶反应的最佳温度是37C。,连接反应的温度,1. 最佳温度,但在37下粘性末端的结合很不稳定。,2. 实用温度,所以一般采用 415 C。,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,1. 插入片段与载体的浓度比例,2. 反应温度,影响连接反应的因素,1020倍。,连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度： 415度,粘性末

19、端DNA片断的连接,DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。 具有相同粘性末端的DNA通过碱基互补既可连接在一起。,同种内切酶生产的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,粘性末端DNA片断的连接最主要缺点 1、无法控制外源基因的插入方向 2、由于具粘性末端的载体易发生自连。 对载体的5末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。 而外源片断的5-P能与载体的3-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分

20、子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5-P的链不能进行连接，形成3- OH 和5- OH 的缺口。,平末端DNA片断的连接 1. T4DNA连接酶 2. 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法,同聚物加尾法 是由美国斯坦福大学的P.Labban和D.Kaiser1972年发展起来的，可以连接任何两段DNA分子的普遍性方法。 原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分子单链延伸末端的3-OH上。如果在目的基因两侧加polydA，则在载

21、体两侧加polydT。长度一般1040个残基。 缺点：插入的片段难以回收。无法控制外源基因插入方向。,人工粘性末端的连接 平头末端,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3,C,退火,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAAAAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,S1,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,加热,人工粘性末端的连接 3突出末端,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCAT

22、G 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,Pst I,Pst I,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,人工粘性末端的连接 5突

23、出末端,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,退火,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,衔接物（linker)连接法 所谓衔接物是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识