免疫组化讲课原理及方法.ppt

1、免疫组织化学技术的原理及方法,北京友谊医院病理科 黄受方,免疫组织化学技术的原理及其方法,一. 基本知识 二. 基本原理 三. 方法 四. 结果的判断及异常着色原因分析和对策,一、免疫组化技术的基本知识,一、 免疫组化技术的基本知识,免疫组化的基本概念 利用抗原-抗体特异性结合原理检测抗原或抗体一般是用抗体检测抗原 抗原 两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具有抗原性 抗体 与抗原能特异性结合生物学结合是免疫球蛋白Ig,免疫球蛋白的化学结构及其模式图,免疫球蛋白根据重链结构命名 IgG(), IgA()，IgD(), IgE(), IgM() 五种免疫球蛋白只有两种类 型的轻连，即： K

2、appa()和Lambda() 每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子 决不可能既有链又有链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。,免疫球蛋白的化学结构及其模式图,Fc(Fragment crystalline) 是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段与抗原特异性有关 Fab(Fragment antigen bingding) 该端是抗体与抗原特异性结合的部位，每分子Ig能结合2个抗原分子,Fc Fab Ag,多克隆抗体与单克隆抗体及其产生,多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体 单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）所

3、产生的抗体,多克隆抗体,单克隆抗体,多克隆抗体与单克隆抗体及其产生,多克隆抗体的产生 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。 常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录上常以RaH（Rabbit against Human）表之。 多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。,多克隆抗体与单克隆抗体及其产生,单克隆抗体的产生 应用细胞融合的杂交瘤技术（Hybridization），以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融合形成杂交瘤，其

4、特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人（抗原）的抗体常以MaH表示，现在亦有兔的单克隆抗体,免疫小鼠Mouse,抗原的制备： 传统用蛋白提纯 近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗原的制备 现有兔的单抗,多克隆抗体和多克隆抗体的选用 单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。 单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感性高，为何使用完全决定于使用的目的性,市售抗体的种类 某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如

5、-胰蛋白酶 有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。如Desmin来源于鸡的肌肉 近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性,标记抗体,在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到 标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒 标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低,酶 抗酶抗体复合物,通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如PAP复合物（Peroxidase AntiPeroxidase Complex

6、），PAP复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。,亲和素生物素复合物（ Avidin-Biotin Complex ABC ）,亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性 AB复合物多用于ABC法的免疫组化中,酶标亲和素（Labelled streptavidin）,在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生

7、物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感,多聚物载体,一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物,一步法：EPOS,tissue antigen dextran backbone primary antibody enzyme molecule,二步法：EnVision,葡萄球菌蛋白A （Staphy

8、lococcal protein A, SPA）,二、免疫过氧化物酶染色技术的基本原理,免疫过氧化酶染色技术的基本原理,识别系统,特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术的理论依据所在 特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用 特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用 识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完成,显示系统,也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗原的存在及其定位 显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点形成有色

9、分子的终末产物，若显色剂为DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀 E(酶)+S(底物) ES(酶底物复合物) P(反应产物) + E(酶) 循环使用,显示系统,辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 HRPH2O2 有色分子终末产物 + HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRPH2O2：酶底物复合物,免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异： 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： 利用PAP复合物 ABC法： 利用AB复合物 LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体,其目的都是

10、设法提高免疫组化染色的敏感性,显示系统,联结系统,联结或桥联抗体（一般为第二抗体） 按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统一体 应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多克隆还是单克隆： 若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物的抗兔血清； 若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血清 有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗,三、免疫组化染色方法的类别,免疫组化染色方法的类别,直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 两步法（Envision）,直接法,将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。 优点：特异性高、非特异染色轻。 缺点：敏感性低

11、，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记,间接法,将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗） 一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔 优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 缺点：特异性差,Primary Antibody,PAP法（Peroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶-抗过氧化酶法）,组成： 一抗是针对靶抗原的特异性抗体 二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物 三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP）,PAP法（Peroxidase-AntiPeroxida

12、se，过氧化酶-抗过氧化酶法）,优点： PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高 PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 可用于福尔马林固定的石蜡切片,PAP,Primary Antibody,Secondary Antibody,Peroxidase-anti-Peroxidase,ABC法（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法）,组成： 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素） 优点： 亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过

13、PAP法。 能用于常规石蜡切片。,亲和素生物素复合物（ Avidin-Biotin Complex ABC ）,亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性 AB复合物多用于ABC法的免疫组化中,ABC法（Avidin-Biotin Complex，亲和素-生物素法）,一抗,二抗,ABC,DAB,ABC,ABC与PAP 法的比较,LSAB（SP）法（labelled

14、 streptavidin biotin method）标记的链霉亲和素-生物素法,特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上 优点： 更快速：空间结构更小 更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点 非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结,酶标亲和素（Labelled streptavidin）,在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感,SP,Primary Antibody,Biotiny

15、lated Secondary Antibody,Ensyme-conjugated Streptavidin,ABC与LSAB(SP)法的比较,一步法（EPOS）及两步法（Envision）,特点 以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法） 优点 操作简便，省时 提高了敏感性和特异性 减少了背景着色 避免内源性生物素的干扰,多聚物载体,一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能

16、与二抗相联结的由HRP标记的多聚物,一步法：EPOS,tissue antigen dextran backbone primary antibody enzyme molecule,二步法：EnVision,一步法（EPOS）及两步法（Envision）比较,EPOS一步法,Primary Antibody,EnVision二步法,四、免疫组化染色结果的判断及异常着色的原因分析及其对策,特异性着色具备特点 特定的组织 特定的定位 特定的细胞 特定的细胞内的部位 分布上的不均一 着色的不均一性 着色强度的不均一 颗粒性显色：DAB显色剂应为棕黄到棕褐色,免疫组化染色结果的判断,CK染色，结肠腺

17、癌细胞膜特异性着色,Kappa 胞浆着色,TdT染色，胞核着色,PR 胞核着色,ER 胞核着色,免疫组化染色结果的判断,对照的设置 空白对照 阳性对照 吸收试验对照 替代对照 自身对照,异常着色（假阳性）原因及对策,异常着色原因,内源酶及内源性生物素 抗体本身原因 切片制作不当 冲洗不充分 DAB显色产生背景着色,抗原的丢失 抗原的遮蔽 抗体试剂因素 操作不当,假阴性的原因,内源酶及内源生物素,非特异性着色原因及对策,灭活过氧化物酶-3%H2O2 灭活内源性生物素-蛋清封闭或更换不含生物素的染色系统 灭活碱性磷酸酶,Desmin,异常着色原因及对策,S-100,异常着色原因及对策,异常着色原因及对策,清洗不充分,用含盐的缓冲液充分冲洗，可利于减低背景着色,DAB显色产生背景着色,未除去DAB的不溶性颗粒 DAB保存不妥，其氧化产物沉淀在组织上,电荷吸附,加二抗动物非免疫血清 牛血清也常用,非特异性背景着色原因及对策,假阴性的原因分析及对策,抗原的丢失 标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高