流式细胞技术与图像处理.ppt

1、FLOW CYTOMETRY,流式细胞技术,流式细胞术,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 原理：以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(微粒)的性状进行定性、定量分析和分选。,流式细胞仪简介,流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞仪特点,单细胞悬液或生物颗粒,

2、分析速度高,多参数,精度高,当代最先进的细胞定量分析技术,流式细胞仪的分类,分析型流式细胞仪 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。 分选型流式细胞仪 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； 进样管道较长，需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选，不兼单纯分析。,BD公司产品 FACS Calibur,特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析,台式机 双激光四色，市场覆盖率最高,FACSAria ,科研型分选流式细胞仪,特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板

3、上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析,FACS Vantage DiVa,科研型（大型机）,特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选,Beckman Coulter流式细胞仪,Epics XL 单激光四色，市场覆盖率高，分析型,CyAn三激光九色，分析型,FC 500 单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型,Gallios 三激光十色，分析型,MoFlo XDP 高端分选型,第一节 流式细胞仪结构组成,液流系统 光学系统 电子数据系统 细胞分选系统,液流系统,液流系统,鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液

4、(sheath)。 流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。,鞘液,鞘液,细胞流,激光照射点,流体动力学聚焦示意图,液流驱动系统,进样速率控制,通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。,光学系统,激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。,光学原理,散射信号与荧光信号,荧光信号,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状

5、态时释放出的光。,发射波长(荧光波长) Emission wavelength,激发波长 Excitation wavelength,电子数据系统,电子数据系统构成：,光电检测器 将光信号转换成电子信号。 前置放大电路 将信号等比例放大，输出电脉冲信号。 模数转换器 将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。 数据处理系统 计算机系统数据采集、分析。,光电检测器(photodetector),光电二极管(photodiode) 光灵敏度低，测定强信号（FSC）； 光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。,光信号的

6、类型： 散射光信号：与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC); 侧向散射光(side scatter, SSC). 荧光信号 自发荧光 ：微弱 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。,流式细胞分析的信息光信号检测,流式细胞的基本信息: “形态”,散射光的作用,实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。,粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,红细胞、死细胞和碎片,流式细胞的主要信息:Fluorescence,FL1 FL2 FL3 FL4,最常用的标记方法是荧光素分子标记的

7、抗体与细胞抗原结合,Forward scatter (FSC) Side scatter (SSC) FL1-绿色 FL2-黄色、橙色 FL3-红色 FL4-红色,流式常见图形 (Histogram Plot),适用于：单参数分析,DNA倍体分析,抗原表达分析,流式常见图形 (Dot Plot),散点图,伪彩图,假三维图和三维图,等高图和密度图,等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。 密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。,设门与数据分析,门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和

8、设门的过程。,椭圆形,圆形,十字门,线性门,流式分选,电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、培养板),lasers,断裂点(充电),高压偏转板,第二节 流式细胞术的科研应用,分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量,流式应用常见范围,细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列等 细胞浆内分子：胞内细胞因子等 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡、PH、Ca+、细胞活性等,样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋,单细胞 悬液,标记 荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学 分析,继续 培养,实验标本

9、的处理,单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体,细胞染色,染色要求： 特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群 非特异反应水平低 抗体效价高，用量适用于常规标本 使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度,抗体的选择,首选直接标记抗体 荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适 合弱抗原的检测,实验对照的设计,空白对照：ALL 阴性对照：评估非特异反应水平，界定阴性范围 常用同型抗体对照 单色分

10、析：设阴性对照（或同型抗体对照） 多色分析：阴性对照（或同型对照），单阳性对照 （用于仪器校正），补偿调整管 阳性对照：确定抗原表达正常时的抗原表达强度和百分含量。（特别在检测阴性时）,流式检测应用实例,细胞表面、细胞内分子检测 细胞周期分析 细胞凋亡分析,淋巴细胞表面抗原分析,样本来源 新鲜抗凝全血 PBMC 单克隆荧光抗体染色 溶血 洗细胞 固定 上机检测,淋巴细胞细胞内抗原分析,样本来源 新鲜抗凝全血 PBMC 细胞表面抗体染色 溶血、固定 细胞打孔 细胞内抗体染色 上机检测,细胞周期分析：,G1,M,G2,S,Quiescent cells,G0,处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同，

11、G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA，而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍体量之间。 DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例。,样品制备,1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞,PBS漂洗 两次,70%酒精 4度固定过夜,收集固定的细胞,PBS漂洗,PBS 悬浮细胞,2.5l 10g/l RNase A,37消化1小时,过300目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)

12、，,1000rpm5分钟 离心,两次,混匀，室温 静止5分钟,上机,DNA 流式检测的主要指标,DNA 含量: ploidy：细胞内染色体DNA含量 DI：测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细 胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性 PI：增殖细胞占总周期细胞的比例 CV： G0/G1期细胞DNA含量变异系数,Annexin V Assay （建议用于悬浮细胞）,在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。 在Ca2+存在时，Annexin V 与PS 有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。 PI 被用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。坏死细胞可以同时与annexin V-FITC 和PI 结合显色，而PI