Mc1-1.ppt

1、蛋白MCI表达对黑色素细胞增殖侵袭的影响,RNA干扰抑制机制,作者,09七年儿科2009210051 轩兴田 2009210069 封叶 2009210075 黄梦媛 2009210084 刘星宇 2009210093 文珊 2009210100 杨盼,研究背景,黑色素瘤（malignant melanoma,MM）是一种高度恶性的肿瘤，多发生于皮肤，国外统计占所有恶性肿瘤的1%2%，在癌症死亡病例中，MM约占1%。且发病率有逐年上升的趋势。其转移早而广发，而且对常规放化疗效果欠佳，是一种临床治疗上颇为棘手的恶性肿瘤。,P53,p53是迄今为止发现的最重要的肿瘤抑制因子，它在人类50%以上的肿

2、瘤细胞中都发生了各种不同程度的突变。但在黑色素瘤中，p53在多数情况下并不发生突变而且含量高，不具有抑制肿瘤的能力，甚至在某些药物作用下，p53还起到保护肿瘤的作用。因此，黑色素瘤对大多数肿瘤治疗药物具有明显的抗性作用，治疗效果很不理想，这一“反常”现象长期困扰着科研人员。,微小分子,是一种依赖肿瘤抑制因子的分子，在黑色素瘤中，通过调控该小分子的含量，经过一系列信号传导，最终增加抑制细胞凋亡的蛋白MCI的含量，从而使黑色素瘤细胞得以生存，这就揭示了黑色素瘤形成的机制。,黑色素瘤的一个发生机制,P53 RNA149*分子 抑制细胞凋亡 蛋 白MCI-1 黑色素细胞得以生存,研究目标,运用RNA干

3、扰技术，研究基因沉默后对黑色素瘤细胞生长，侵袭能力的影响。,设想1使P53沉默,P53 RNA149*分子 抑制细胞凋亡 蛋 白MCI-1 黑色素细胞得以生存,设想1使P53沉默,P53 RNA149*分子 抑制细胞凋亡 蛋 白MCI-1 黑色素细胞凋亡,可是，这里有个问题.,P53抑癌基因是生物体内一种抑制细胞转变癌细胞的基因。 一旦p53基因发生突变，P53蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变，人类50%恶性肿瘤中该基因发生突变失活。 我们若使抑癌基因沉默，那就可能诱发新的肿瘤。,设想2使MCI-1沉默,P53 RNA149*分子 抑制细胞凋亡蛋 白MCI-1 黑色素细胞 得以生存,黑色素

4、瘤的一个发生机制,P53 RNA149*分子 抑制细胞凋亡 蛋 白MCI-1 黑色素细胞凋亡,研究思路,确定目的基因 设计siRNA序列 siRNA基因真核表达载体的构建与鉴定 转染黑色素瘤细胞，筛选稳定表达干扰载体的黑色素瘤细胞株 检测黑色素瘤细胞增殖水平的变化 检测黑色素瘤细胞MCI-1蛋白分子量的变化 黑色素瘤细胞体外侵袭力测定,确定目的基因：MCI-1,1 gggaagtcct cgcctgcgtc agcacggccc taaggcggcg gcagggaacg gccttcctca61 ctcctgactt ccgcctgcct ccggtctgga gtcgcggcct tccc

5、cgctcc ttcccctcag121 cctgcggcgt ccgaccatgt ttggcctgcg gagaaacgcg gtcatcggct tgaacctgta181 ctgcggcggc gccagcctcg gcgcgggcgg cggttctccg gcaggggcgc gcctggtggc241 cgaggaggcc aaggcgcggc gcgagggggg aggggaggcc gccctgctgc ccggcgcgcg301 ggtggtcgcc cggccgccgc ccgtgggcgc cgaggacccc gacgtcaccg cgtcggccga361 aag

6、gcggctg cataagtcgc ccggcctcct cgccgtgccg cccgaggaga tggccgcgtc421 ggccgccgcc gccatcgtgt ctccggagga ggaactggac ggctgcgagc cggaggccat481 cggcaagcgc ccggccgtgc tgcccctcct ggagcgcgtg agcgaggcgg ccaagagctc541 cggggccgac ggctctctgc cctccacgcc gccgccgccc gaggaggaag aggacgacct601 ataccgccag tcgctggaga tcatc

7、tcgcg ctacttgcgg gagcaggcga ccggctccaa661 ggactcgaag cctctgggcg aggcgggcgc ggcgggccgg agagcgctgg agaccctgcg721 gcgcgtgggc gacggcgtgc agcgcaacca cgagacggcc ttccagggca tgctccggaa781 actggacatt aaaaacgaag gcgatgttaa atctttttct cgagtaatgg tccatgtttt841 caaagatggc gtaacaaact ggggcaggat tgtgactctt atttctt

8、tcg gtgcctttgt901 ggccaaacac ttaaagagcg taaaccaaga aagcttcatc gaaccattag cagaaactat961 cacagatgtt cttgtaagga cgaaacggga ctggcttgtc aaacaaagag gctgggatgg1021 gtttgtggag ttcttccacg tacaggacct agaaggcggc atcagaaatg tgctgctggc1081 ttttgcgggt gttgctggag taggggctgg tctggcatat ctaataagat agccttgtga1141 gtg

9、caatagg ggactcttaa agctccagcc accaaactac atgcatctgt gaaaacatgt,设计siRNA序列目标序列的筛选：,target: ttaacaacgttggtgactt sense: uuaacaacguuggugacuuAA antisense:AAaauuguugcaaccacugaa 同源性分析：23.3%,target: taaatatccattactctgc sense: uaaauauccauuacucugcAA antisense:AAauuuauagguaaugagacg 同源性分析： 24.3%,target: ctatgcag

10、ggttaattatc sense: cuaugcaggguuaauuaucAA antisense:AAgauacgucccaauuaauag 同源性分析：12.1%,target: gctgcccaggattttaaca sense: gcugcccaggauuuuaacaAA antisense:AAcgacggguccuaaaauugu 同源性分析： 28.2%,target: catagcaaaaagaaagtgg sense: cauagcaaaaagaaaguggAA antisense:AAguaucguuuuucuuucacc 同源性分析：20.2,选取mcl-1作为靶序列，另外，设计一个阴性对照siRNA-control如下：,target: ctatgcagggttaattatc sense: cuaugcaggguuaauuaucAA antisense:AAgauacgucccaauuaauag 同源性分析：12.1% 阴性对照siRNA-control： acugacugugaauguauucAA,siRNA,RISC蛋白复合体,RISC,siRNA解链,活化的RISC,结合目的mRNA,mRNA,活化