深圳大学 MTT比色法测定细胞生长曲线 细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算.ppt

1、1.MTT比色法测定细胞生长曲线2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算,冯刚 2012级生物医学工程（工）2120220205,2020/10/13,1.MTT比色法测定细胞生长曲线,2020/10/13,细胞生长曲线,细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。,一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的迟缓期（潜伏期），即进入大量分裂的对数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入稳定期，然后退化衰亡。 以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。 一般而言，我们主要研究的是对

2、数生长期的生长曲线。,2020/10/13,测定细胞生长曲线的方法,1.细胞计数法（简单、最常用、有误差） （1）传代后把细胞重悬，得到细胞悬液，把悬液均匀加到24孔板中 （2）24 h后开始进行细胞计数，以后每隔24 h计数一次，每次取4孔细胞，分别进行计数，计数结果取4孔的平均值。连续计数6天。 （3）根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 24孔板 细胞计数板,2020/10/13,2.MTT法（复杂，误差小）,原理 MTT：全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bro

3、mide 汉语化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。 活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶能够使外源性的MTT还原，同时在细胞色素C 的作用下，生成不溶于水的蓝色（或蓝紫色）络合物甲臜。 按照时间间隔，通过酶联免疫检测仪在490nm（或570nm）波长处测定甲臜 的光吸收值（A值）。 在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光吸收值推算出活细胞的数目。 由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入 MTT 不会有反应。,2020/10/13,1.标准曲线的测定: 例如：用培养液将待检细胞重悬，得到细胞悬液，按照4x104/ml细胞

4、密度梯度 ,分别接种于 96孔板 ,每孔 100l,重复 3孔;采用 MTT法测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值为该浓度下3孔的平均值。 依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度的对应关系，绘出标准曲线。 2.细胞生长曲线的测定: 例如：用培养液将待检细胞制成 1104/ml的细胞悬液;分别接种于多块96孔板 ,每孔 100l ;在 24、 48、 72、 96及 120 h时间点取一块 96孔板 ,采用 MTT法测量吸光值A值得到吸光值A值与时间的关系。 根据标准曲线计算出相应的细胞数 ,再绘出细胞的生长曲线。,2020/10/13,2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算,202

5、0/10/13,曲线拟合 曲线拟合（curve fitting）是指选择适当的曲线类型来拟合观测数据，并用拟合的曲线方程分析两变量间的关系。 SPSS SPSS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功，同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、在芝加哥组建了SPSS总部。 1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分析软件微机版本SPSS/PC+，开创了SPSS微机系列产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围，并使其能很快地应用于自然科学、技术

6、科学、社会科学的各个领域。,2020/10/13,通常地，细胞生长曲线的函数拟合模型是 但由于细胞增值是二次分裂生长，所以选用 作为细胞生长曲线的拟合模型更为合适。,2020/10/13,又因为在SPSS中的曲线拟合功能选项中并没有 的 函数拟合模型，只有 于是我们可以通过变换 从而能使用SPSS中的函数拟合模型进行曲线拟合。,2020/10/13,原始数据,2020/10/13,曲线1. 培养天数 X ln2 曲线2. 进入对数生长期天数 X ln2 依据以上变量进行曲线拟合,记录相应的a,b值。,2020/10/13,2020/10/13,2020/10/13,2.2 细胞群体倍增时间的简化计算方法,2020/10/13,细胞群体倍增时间的计算方法有2种。 1.做图法:在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间,即倍增时间, 2.公式法,按细胞倍增时间计算细胞群体倍培时间,其为公式为： （Nt为对数生长期任一点的理论观察值,N0为对数生长期理论初始值） 计算比较复杂,而我们基于以往曲