RNA剪接1.ppt

1、RNA拼接（RNA splicing）：一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟RNA分子的过程,拼接点： 5 拼接点或左拼接点（内含子上游） 3 拼接点或右拼接点（下游）,2、 内含子的分类,1982 Davies等人,中部核心结构（central core structure）:在有些内含子 中，含有4个重复的保守序列，长度为 10 20bp，4个保守序列构成一种二级 结构，在拼接中起重要作用,由于并非所有的内含子都有中部核心结构，所以有了内含子的分类, 类内含子（group ）:含有中部核心结构 细胞器基因 核基因, 类内含子（group

2、）:不含有中部核心结构 细胞器线粒体基因内 核基因, 类内含子 （group ）:具有 GUAG 特征的边界序列 核基因mRNA前体, tRNA基因的内含子 均位于 tRNA 的反密码环上,四种内含子的边界序列各有一定共同的特征,3、拼接方式,方式一：由拼接装置完成（核mRNA内含子） 可供识别的特异序列 拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成,方式二：自我拼接（两类内含子 、 ） 形成特定的二级结构 RNA具有催化拼接的能力,方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA） 前两种拼接都属于转酯反应,二、tRNA的拼接（酵母为例）,1、链的断裂和连接是两个独立的过程,2、tRNA的内含子均位于反密码

3、环的3端，与反密码子相距 一个Nt,长1416bp，其中含一段与反密码环互补的序列 反密码环处形成一个与成熟tRNA不同的构象,酵母tRNAphe,4、 拼接过程 研究方法 构建温度敏感突变体（高温时.）,分离累积tRNA前体,体外加入野生型细胞抽提液,研究拼接过程,第一步：内切酶作用,释放一条线状内含子分子 和两个“tRNA半分子”,两个tRNA半分子采取成熟tRNA分子的构象,拼接过程,第二步： RNA连接酶连接断端,其中 内切酶作用后产生 5OH 和 3磷酸，3磷酸端很快转 变为2，3环式核苷酸,因此，一个半分子有两个磷酸末端，一 个半分子有两个 OH末端,连接反应前要进行两个反应：,a

4、、左外显子的3端成为OH （环式磷酸二酯酶） 其 3 位为OH， 2 位为磷酸,b、第二个外显子的 5端转变为 磷酸基（多聚核苷酸激酶）,因此 连接后还要切除第一个外显子的 2磷酸 这是 tRNA内含子拼接重要特点之一,前体RNA,两个半分子,进行两个连接反应,成熟tRNA,三、第 类内含子的拼接 特点： 拼接属于自我拼接 形成明显的二级结构 1、 结构特点： （1） 5 拼接点和3 拼接点-U G , 5 exonUintronGexon3,（2） 有由保守序列形成的二级结构 a、 保守序列为 5 PQRS3 距拼接点很远，各 1012bp P与Q互补、R与S互补而形成中部核心结构,b、 二

5、级结构中还包括内含子与外显子的某一序列互补所形成的二级结构,内部引导序列（interal guide sequence IGS）：内含子中能与两个拼接点边界序列配对的一段序列,# 第一类内含子的拼接依赖于以上二级结构 为自我拼接的进行提供活性位点,2、 拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例） （1） 两种rRNA转录在一条35S的产物中，26SrRNA 有内含子,5 U G 3 小rRNA 大rRNA（26S 有内含子）,（2） 35SRNA体外有自我拼接的能力 反应需要：一价和二价离子 鸟苷酸辅助因子（GTP GDP GMP和 鸟嘌呤核苷） 不需能量的供给,（3） 拼接反应后，G与内

6、含子（414base） 5端以磷酸二酯键相连 （放射性标记试验）,（4） 具体的拼接过程 第一步： 游离G发动的转酯反应 G 的 3-OH 攻击内含子的 5拼接点,G- 内含子、左外显子（有游离3OH）,第二步： 游离外显子（左）发动的转酯反应 左外显子的3-OH 攻击3拼接点，同时释放 线状的内含子,形成成熟RNA分子, 两次转酯反应是紧密偶联的 释放出的内含子可继续进行转酯反应 而形成环状,（5） 自我拼接过程主要由转酯反应构成，且完全由内含子自身完成-自我拼接的最大特点, 转酯反应是将一处已有的磷酸二酯键变成另一处新的 磷酸二酯键, 内含子自身能形成特定的二级结构，产生适于拼接反 应的构

7、象和活性位点,在G的参与下完成拼接反应 (内部引导序列),这一机制如下图所示 :,科罗拉多大学Cech等人完成（美）,活性位点,3、内含子的催化功能,35SRNA前体拼接释放的内含子（414base）进行的自身转 酯反应,（1）线状分子自身环化能力及环化后的逆环化,逆环化,逆环化,（2） C15: 逆环化 将UUU加到 5端的能力 表明: 该环形产物具有连接两个RNA分子的能力,（3） L19： 具有酶活性 即Cech等人证明的 L19 的 polyC 聚合酶活性,L19 分子,L19 分子,（4）总结： a、 四膜虫的 35SRNA 的内含子有自身催化的性质 即 - 将一处已有的磷酸二酯键转

8、变成另一处新的磷 酸二酯键，不需要额外的能量,因此： 内含子可以看作是 RNA重排酶（RNA rearrangease） 或 RNA异构酶（RNA isomerase）,其中： 拼接反应中，“酶” 和底物是同一个分子，且反应后 变成了不同的分子,b、L19的 polyC 聚合酶活性进一步表明 L19 具有酶的 主要特征：,专一性强,加快反应速度,反应前后酶分子保持不变,人们称这种由RNA构成的酶为-,核糖核酸质酶（ribozyme） 可简称 R酶,四、第二类内含子的拼接,1、拼接点序列,7核苷酸的保守序列 （Branch Site ） 3 拼接点上游 6bp 12bp 处, 5-exon- G

9、UGCG-B.S-Py AU -exon-3,供点,受点, 在Branch Site 的两侧存在一些短的序列， 与其上游10-50Nt处互成 IR,形成茎环结构(但A 不包含在 IR序列内, 从而被排除成芽状突起）,5-GUGCG-PyPuPyPyUAPy-PyAU3,Intron,IR IR,5 G AU 3,A,2、拼接机制（Splicing mechanism）,Int ron,IR IR,A,5 G AU 3,Exon 1 Exon2 G A,intron,PyAU,Matural RNA “Lariat” intron 套索状内含子,转酯攻击位点,intron,OH AU,2 A,3

10、,G,五、核基因mRNA内含子的拼接,1、相关概念 Euk.的细胞中，有许多碱基数在100 300之间 的小分子RNA,每个细胞有 105106个,snRNA： 细胞核中的 （snRNP） scRNA： 细胞质中的 （scRNP）,2、核mRNA内含子拼接的结构特点,内含子拼接与其他加工同时进行,拼接点序列,Breathnach-Chambon rule （GUAG规则）, 7Nt branch site 3拼接点的上游,3、拼接机制（Splicing mehanism ), SnRNA (or ScRNA) 与拼接点序列间存在互补区域 并参与剪接, 形成拼接体( spliceosome)。,

11、 Spliceosome 逐级组装， SnRNA（U1、U2、U5和 U4U6）分步替代, U1通过与 5拼接点互补而结合,U2识别并结合分支 点A,U1和U2作用使内含子的 5端和 3端带到 一起（U1与 3拼接点配对）,U1、U2、mRNA与 U4U5U6复合物形成一个完整的拼接体, 第一次转酯左外显子、内含子剪切套索,lariat, 第二次转酯exons连接、套索状内含子释放, 拼接体（spliceosome） 解体与lariat降解同步,名词解释 转录 启动子 RNA拼接 左、右拼接点 不连续转录 反式拼接 转录终止子,简答题 1、说明RNApol全酶各个亚基的主要功能。 2、以E.coli为例，说出Prok.启动子结构及各部分功能。 3、以Prok.为例简述转录起始过程。 4、终止子和终止密码子有何区别？ 5、试述Prok.中转录终止子的类型及终止机制。 6、解释E.coli的噬菌体调控不同发育阶段基因表达的抗终止机 制。,7、 简述内含子