基因工程实验(答案)

1、.凯1. 简述本学期从基因组dna提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结）答：基因组dna的提取；pcr扩增目的基因；凝胶电泳分离纯化pcr扩增的dna片段以及dna的体外连接；重组质粒的转化及转化子的筛选；重组质粒的抽提；重组质粒的酶切鉴定。2. 如何正确使用微量移液器？（自己写的）答：选取合适量程的移液器；根据取液量设定量程；安装（吸液）枪头；按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；按至第二档将液体打入容器；弃掉枪头；将量程调至最大，放回原处。3. 在琼脂糖凝胶电泳点样时，dna通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？答：loading buffer。主要成分为溴酚蓝，二

2、甲苯青和甘油。溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。4. 简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义）答：取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1tbe溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解；将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55下后，缓慢导入该胶室里；量取合适量1tbe溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；点样；轻放移胶板至电泳槽的合适位置；打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经be染色放入成像系统显色、观察。5. 琼脂糖凝胶电泳中dna分子迁

3、移率受哪些因素的影响？（实验书p75）答：样品dna的大小和构象；琼脂糖浓度；电泳电场；温度；缓冲液；嵌入染料的存在与否；6. 在使用苯酚进行dna抽提时应注意什么？（实验书p31）答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。7. 在基因组dna提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？答：酚是蛋白质变性，抑制dna酶的降解作用；氯仿除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇降低表面张力，从而减少气泡的产生。8. 提取dna实验中，通常可选用哪些试剂沉淀dna？答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.10.25mol/l 的nacl9. 简述在dna提取实验中个试剂的作用（sds，ed

4、ta，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。答：sds破坏细胞膜，解聚核蛋白；edta整合金属离子，抑制dnase活性；酚/氯仿/异戊醇见第7题；无水乙醇沉淀dna；70%乙醇洗涤dna沉淀。10. 简述pcr扩增技术的原理及各种试剂的作用（mg2+，dntp，引物，dna，缓冲液，taq dna聚合酶）。精品.答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的dna为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，经高温变性，低温退火，适温延伸三个步骤合成特异dna片段。（2） mg2+：taqdna聚合酶的活性需要；dntp：作为底物；引物：作为延伸的出发点；dna：模板；缓冲液：维持反应环境的ph值；t

5、aqdna聚合酶：催化dna的合成。11. pcr循环次数是否越多越好，为什么？答：否。因为pcr产物的积累存在平台效应。12. 降低退火温度，延长变性时间对pcr结果有什么影响？答：前者会使非特异性产物增多；后者会导致酶的活性降低。13. 如果检测的pcr结果中出现很多非特异性条带，可能有哪些原因导致？答：引物特异性不强；mg2+浓度过高；引物二聚体形成；退火温度过低；循环次数过多。14. 简述dna片段回收纯化的原理。（？）答：各dna片段的大小不同，则经琼脂糖凝胶电泳后得到了分离，收集含有dna的凝胶部位通过溶解凝胶、使dna与硅胶柱结合、再通过洗涤杂质、最后dna洗脱，通过新的ep管收

6、集等，最终得到纯化的目的。15. 为什么dna体外连接反应反应要设在16？答：因为此温度下能最大限度的发挥连接酶的活性，同时有助于维持短暂配对结构的稳定。16. 简述ta克隆试剂盒进行体外连接的原理。（实验书p149）答：经dna聚合酶得到的pcr产物双链dna片段的末端具有一个突出“a”碱基，而t载体每条链的3端带有一个突出“t”碱基，则其两端可以与pcr产物的两端进行正确的t-a配对，再在连接酶的催化下，即可将目的片段连接到载体上，形成重组载体。17. 简述氯化钙制备感受态细胞的原理。（实验书p153）答：经低温预处理的低渗cacl2溶液处理受体细胞后，则可使细胞的通透性增大，从而极易与外

7、源dna相黏附并在细胞表面形成复合物。18. 重组质粒的转化方法有哪些？答：cacl2法，电击法，农杆菌转染法；花粉管通道法，基因枪法等。19. 当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有amp的lb培养基平板前，为什么要在lb培养基上培养1h？答：使感受态细胞复苏，同时让重组质粒在感受态细胞中适应并富集，以便于表达产物，使受体细胞具抗性能力。20. 什么情况下转化平板上会出现卫星菌落，为什么会出现卫星菌落？答：涂布后的培养基培养时间过长。精品. 因为载体上的抗性基因的表达产物由于培养时间过长而得到积累，使加入的抗生素失效，从而让不含质粒的空菌落的一大量生长，故出现卫星菌落。21. 碱裂解细胞抽

8、提质粒的基本原理是什么？答：当菌体在naoh和sds溶液中裂解后，dna和蛋白都发生变性。当加入中和液后，由于构象上的区别，质粒dna能较快的复性呈溶解状态，离心时留在上清液中，而染色体dna不能复性，从而形成缠绕的网状结构并与蛋白凝聚，因离心沉淀。22. 电泳检测提取的质粒是会看到三条带，这三条带分别代表了什么？答：最前端为超螺旋，中间为开环dna，最后为复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。23. 质粒抽提中溶液、的作用是什么？答：溶液使沉淀重新悬浮；溶液让染色体dna和质粒dna变性；溶液中和碱，使质粒dna复性。24. 什么是限制性内切酶的星号活性？答：在某些条件下，一种特异性识别序列的限制酶在酶切同一种dna片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性。25. 细菌产生的限制性内切酶，为什么不对自己的dna进行切割？答：因为细菌能通过甲基化酶的甲基化作用保护自身的dna不被相应的限制酶降解。26. 影响限制性内切酶的因素有哪些？使用工具酶时应注意什么？答：（1）dna样品中的污染物，如有机溶剂等；缓冲体系；温度；样品量。（2）酶量使用少，确认样品是否加入反应体系；吸取各试