第八章植物原生质体培养及细胞融合

1、33 第八章 原生质体培养与细胞融合,第一节 原生质体培养,一、 原生质体的培养概况 1、概念： 植物的原生质体(Protoplast)指除去细胞壁以后的裸露细胞。 原生质体培养（Protoplast culture）是将游离的原生质体进行培养，通过细胞的分裂与分化，形成完整植株的过程。 植物细胞壁上的DNA酶活性较高，当引入外源DNA时，细胞壁上核酸酶对该DNA破坏作用很大。原生质体培养可以避免细胞壁的阻隔，利于细胞器的移植或大分子物质的引入。 原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。,2

2、、意义,1、可将外来遗传信息通过不同基因载体（噬菌体、细菌质粒）引入植物细胞，使细胞性状在分子水平上发生变化，再生出具有新性状的植物。 2、通过异源原生质体融合，充分组合核质基因组，进行植物品种的改良,创建新品种及种质。 3、以原生质体为材料，并进行体细胞遗传、远缘杂交不亲和机理等方面的研究。可进行细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等方面的研究。,二、原生质体的分离和纯化,1 原生质体的分离 叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。 细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。 分离原生质的方法主要有以下两种： （1）机械法： 首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质

3、壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状； 破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用。,（2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（离析酶）、蜗牛酶、和胼胝质(pianzhi)酶等。 1960年，cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。 EA3867纤维素酶，为中国上海植生所纤维素酶小组从野生型

4、绿色木霉通过诱变处理获得的一个酶活性较高的突变菌株。日本R-10纤维素酶，使用于初生壁细胞。 优点：可以获得大量的原生质体，适用于几乎所有植 物和器官。 缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶及酚类物 质，会影响原生质体的活力。,2 影响原生质体数量与活力的因素,细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可使用蜗牛酶和胼胝质酶。 渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。 原生质膜稳定剂 (CaCl2、0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.2-0.3%) pH影响 5.4-6.0,3 原

5、生质体的纯化（净化） 指将酶解后的溶液中的原生质体与组织残渣（如去未脱壁的细胞、细胞碎片）分开的过程。 (1) 沉降法 原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。 首先将含有原生质体与酶混合液过网筛（44169m孔径），除去叶脉大组织块。然后低速离心（9004500r/min）收集沉于底部的完整的原生质体。 一般叶肉原生质体均采用沉降法，优点是采集方便，缺点是不能完全除去少量的细胞和破碎的原生质体。,(2) 悬浮法（漂浮法） 原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后，使原生质体漂浮于溶液表面，而残渣碎屑沉淀于底部。 加0.5M蔗糖溶液

6、，原生质体浮于表面，取出浮于表面的原生质体，反复操作。 这种方法可收集较纯的原生质体，原生质大小较一直，但获得原生质数量少，而且高渗溶液对原生质体有害，收集较沉降法困难。,(3) 界面法 原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处于两液相的界面之中。 在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mm /L蔗糖，一层溶于培养基中的140mm/L蔗糖和360mm/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质体（含有300mm/L山梨醇、100mm/LCaCl2）,轻轻混合，经5, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面液体中，取出界面中的

7、原生质体，按上述方法再重复进行一次。 界面法的优点：可收集到较大的纯净的原生质体，同时避免收集过程中原生质体的破损。,三、原生质体培养方法,(1) 固体培养法（平板法）： 将原生质体均匀固定于琼脂培养基上进行培养的方法。 首先把制备好的融化的琼脂培养基冷却至40，与等量原生质体悬浮液共同倒入培养皿中，迅速而微轻摇动，使原生质体均匀铺在琼脂之中。 (2) 液体培养法： 液体培养法又分为浅层液体培养和悬滴法两种。 浅层培养：将纯化后的原生质体悬浮液(35mL)直接放入培养皿内或三角瓶内进行培养。 悬滴法：将原生质体悬浮液滴入培养皿盖上，每滴510l，皿底放入保湿液，将盖密封培养。,(3) 双层培养

8、法 ：将原生质体悬浮液，倒入已凝固的琼脂培养基上进行培养。液体培养与固体培养相结合，保持湿度较好，同时，培养过程中可定期添加培养基，因此，原生质体生长较快。 四、原生质体培养的影响因素 原生质体的活力与起始密度 培养基成分 培养条件 不同植物与同种材料的不同基因型,第二节 体细胞杂交,体细胞杂交（Somatic cell hybridization）： 通过物理或化学的方法使原生质体融合，通过培养获得具有双亲遗传物质的后代。也叫做原生质体融合（protoplast fusion）。 植物体细胞杂交的主要程序： 原生质体的制备 原生质体融合 杂种细胞的选择 杂种细胞的培养 杂种植株的鉴定,一、原

9、生质体融合,自发融合: 动植物细胞融合现象在自然界普遍存在。植物生殖过程的双受精，雄性生殖细胞与雌性卵细胞与中央细胞发生融合。在酶解法制备同源原生质体时，相邻细胞间发生融合。一般认为，这类融合与胞间连丝有关。 诱导融合: 指将原生质体分离出来以后，再加入诱导剂或其它方法促使两亲本原生质体融合。是依靠诱导剂，克服不同原生质体的排斥力使之彼此融合。,1、物理方法 利用离心、振动、电刺激等物理方法促使原生质体融合。 电融合： 1）微电极控制仪：两个微电极尖端，同时与两个靠近的原生质体表面接触，用512A电波15ms（毫秒）。原生质体发生暂时收缩，引起了原生质膜状态暂时变化，从点连到面再到形成球形融合

10、体约需要2030min。 2）平行电极： 融合槽的两极通过交流电场产生电泳效应，电场产生的力作用于原生质体，使之偶极化，原生质体相互接触形成珍珠串。加适当强度的直流电脉冲，高强度的只需几个微秒就细胞膜发生可逆穿击而形成融合体。,细胞融合仪,Multiporator,细胞先在交流电场中聚集，然后通过直流脉冲融合。 特定的缓冲液体系可帮助完成高效的细胞电融合。,神舟四号飞船上进行的太空细胞顺利融合，返回舱里的电融合仪内孕育出首批国产太空生命 。,2、化学方法： 以不同的试剂为诱导剂，如各种盐类，多聚化合物，生物胶及其降解物等，促进原生质体融合。目前应用广泛的是Kao（1977）聚乙二醇（PEG）和

11、高Ca2+法。 原理：PEG和原生质体表面负电荷通过Ca连接下形成静电键，促进原生质体间黏着和结合；在高Ca和高pH溶液处理下，Ca和PEG分子被洗脱，导致电荷平衡失调而重新分配，使原生质体某些阳电荷和另一些原生质体阴电荷连接、吸附、聚合，最后融合在一起。 PEG+高Ca2+-pH法： 将分离好的不同原生质体悬浮液作为供试材料。 配置适宜浓度的聚乙二醇（PEG）溶液与稀释清洗液。,原生质体的融合： 混合等体积的两种原生质体悬浮液，加入PEG溶液并诱导两者接触、融合；用稀释清洗液冲洗（高Ca2+-pH法）。 培养：,二、融合过程 膜融合：生物膜融合是重要生物学现象，常态膜融合，内胞饮、外胞饮；非

12、常态，如受化学的、物理的、生物的（噬菌体、病毒）等因素的刺激引起细胞病理状态的反应。 从膜融合的过程来看，可以把膜融合的反应分成接触，诱导，融合，和稳定四个时期。而Ca2+、ATP、及ATP酶可调节膜融合的变化；质膜上磷脂状态的改变可以影响质膜构型和流动性的报道。 核融合： 有丝分裂核的融合，融合处理后形成了多核细胞，由于DNA合成不同步，不协调发生核分裂紊乱，形成多中心，核分裂而细胞质不分裂，核合并成块等异常现象，因此多核细胞难以成活。 双亲进行同步分裂，形成共同纺锤体，染色体排列在分裂中期的赤道板上，再继续进行到分裂后期，这样所形成的融合核可继续分裂。,三、融合细胞的筛选,以X、Y分别代表

13、两种植物的原生质体，当两者原生质体诱导融合后，原生质体群中，必然含有未融合的亲本原生质体（X和Y），同种融合体（XX，YY）以及异种融合体（XY）。 1、互补筛选：有白化互补选择、生长互补选择、营养互补选择、基因互补选择、抗性互补选择等。 Carlson(1972)光烟草和郎氏烟草双亲原生质体需要生长素,而杂种细胞在无生长素培养基上就可以生长。凡是在无生长素培养基上生长的细胞,就是杂种细胞。 Gleimelius(1978),以两个烟草硝酸还原酶营养缺陷型突变体为杂交亲本，它们只能在有机氮或氨态氮培养基上生长，不能在硝酸盐培养基上生长，而杂种细胞由于在遗传上的互补，可以恢复硝酸还原酶活力，所以

14、在硝酸盐培养基上生长的细胞即为杂种细胞。,2、机械筛选： 荧光染料标记：单标记、双标记,用不同荧光染料标记两个亲本原生质体，在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。在一个融合体中有两种荧光的细胞为异核体。 异硫氰酸荧光素（FITC）绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）红色,四、杂种植株的鉴定,1 杂种植株和亲本植株的形态学特征 2 杂种和亲本的核型分析,3 同工酶谱分析,过氧化物酶(POD)、超氧岐化酶（DOD）、脂酶、醇脱氢酶等 RuBP羧化化酶：大亚基（LS）母性遗传，叶绿体DNA；小亚基（SS）孟德尔遗传，受核控制。,4 分子生物学方法 分子生物学技术的发展，扩大了鉴定植物细胞杂种分析

15、手段。应用最多是通过双亲及杂种的DNA限制性内切酶片段图谱(RFLP)。 Dudirs(1979)得到胡萝卜羊角芹的染色体数经检查2n=18，都是胡萝卜染色体，但用分子杂交方法证明带有羊角芹特有的RNA，确定是体细胞杂种。,转Barnase 基因植株的PCR检测 1 HaeIII/pBR322 Marker；2阳性对照；3-7转基因材料,PCR检测(限制性片段长度多态性,RFLP）,1 2 3 4 5 6 7,Southern杂交的鉴定,转化有Barnase 基因植株的Southern blotting 分析 1阳性对照，25. 转基因植株, 6. 阴性对照,1 2 3 4 5 6,Melch

16、ers（1978）对野生番茄和马铃薯(2n=24)培养出杂种再生植株，进行了形态染色体和RUBP羧化酶谱分析，而RUBP羧化酶差异最明显。 9株杂种中全都具双亲的RUBP小亚基，而其中5株只有马铃薯的大亚基，4株具番茄的大亚基，前者称Pomatoes (马番杂种)，后者称Topatoes（番马杂种）。属间杂交的先成功，是典型的核质遗传表型杂种.在理论在实践上都有较大价值。 目前已再生植株的种内细胞杂种14个、种间62个，属间47个。 野生芥芥菜(Kirti,1995)，番茄茄(Liu, 1995)。,The prospects of success with the genetic manipulation of plants has created considerable public interest. Melchers and his co-workers (1978) produced a hybrid plant from the fusion of potato and tomato protoplasts, allowing the transfer of genetic information from two different o