发酵条件对产2_3_丁二醇Klebsiellapneumoniae代谢的影响

1、食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES发酵条件对产 2，3-丁二醇 Klebsiella pneumoniae 代谢的影响*孙丽慧，戴建英，王旭东，修志龙( 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连，116024)摘 要 通过批式发酵实验考察了通气量和 pH 对产 2，3-丁二醇的 Klebsiella pneumoniae CICC 10011 代谢特性的影响，确定了发酵 2，3-丁二醇的最适条件为: 通气量 0. 10 vvm，pH 值 5. 8。在该条件下发酵 8 h，目标产物浓度达到 15. 76 g /L，产物得率为 0. 32 g /g 葡

2、萄糖，生产强度为 1. 97 g / ( Lh) 。对发酵过程中细胞生长和主要代谢产物的形成进行分析，结果表明，早期乙酸的形成有利于目标产物 2，3-丁二醇的积累，后期有机酸用作底物维持细胞生存。调节底物浓度、通气量和 pH，使细胞尽早产生足够的乙酸，维持较长的对数生长期是发酵生产 2，3-丁二醇的关键。关键词2，3-丁二醇，发酵，代谢特性2，3-丁二醇( 2，3-butanediol，2，3-BD) 是一种非常重要的化工原料和液体燃料，被广泛应用于化工、食1 3。2，3-品、医药、燃料以及航空航天等多个领域丁二醇的生产方法有化学法和生物转化法。由于其结构的特殊性，采用化学法合成比较困难，成本

3、较高，因而很难实现大规模的工业化生产。生物转化法即以可再生资源为原料，通过微生物代谢将单糖转化为4 5。相比化学合成法而言，生物转化法既目标产物符合绿色化工的要求，又可避免化学合成的困难，同时可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石资源为原料的石油炼制向以可再生生物质资源为原料的生物炼制转型。以生物转化法生产 2，3-丁二醇至今已有近百年6研究了呼吸商对产气节杆菌( Aer-的历史。Zeng 等obacter aerogenes) 发酵 2，3-丁二醇的影响，结果表明，在发酵过程中控制最佳呼吸商可获得高达 96. 0 g /L7从土壤中分离筛选出 1 株克的 2，3-丁二醇。Ma 等雷伯氏菌

4、( Klebsiella pneumoniae) SDM，经离子束诱变后具有高产 2，3-丁二醇的能力，在 5 L 发酵罐中发酵 38 h 可获得 150 g /L 的 2，3-丁二醇。迄今为止，相关报道多集中在高浓度目标产物的获得上，而对 2，3-丁二醇发酵过程中代谢产物的形成规律鲜见报道。2，3-丁二醇代谢途径中副产物较多，包括乙醇、乙酸、甲酸和琥珀酸等，如图 1 所示。在 2，3-丁二醇发酵过程中，pH 和通氧量是 2 个非常重要的因素，它们对菌体生长和产物形成都有显著影响。本研究以 K.第一作者: 博士，讲师( 修志龙教授为通讯作者) 。* 国家高技术发展计划项目 ( 863 计划)

5、( No. 2009AA05Z443) 资助收稿日期: 2010 04 06，改回日期: 2010 05 21pneumoniae CICC 10011 为菌种，通过 5 L 发酵罐中的批式发酵实验考察 pH 值和通气量对发酵过程的影响，确定发酵条件，并在此基础上分析主要代谢产物的形成规律，以期加深对 K. pneumoniae 产 2，3-丁二醇生理及代谢特性的认识。1 材料与方法1. 1 实验材料菌种 K. pneumoniae CICC 10011，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。8种子培养基和发酵培养基见文献。主要仪器: pH 电极; 5 L 自控发酵罐( BIOTECH-5BG，

6、上海保兴生物设备工程有限公司) ; 721 分光光度计; 恒温振荡培养箱; 葡萄糖分析仪( SBA-50B，山东省科学院) ; 气相色谱仪( GC-14B，日本岛津公司) ; 高效液相色谱仪( Waters-600，美国) 。1. 2 方法1. 2. 1 种子培养按 2% ( ) 接种量将 K. pneumoniae 接种到含有50 mL 液体培养基的 500 mL 三角瓶中，在 37 ，摇床转速 190 r /min 条件下，培养 24 h。1. 2. 2 批式发酵实验在 5 L 自控发酵罐中进行。装液量 2 L，接种量5% ( ) ，温度 37 ，搅拌转速 300 r /min，用 5 m

7、ol /L的 NaOH 溶液调节 pH，向发酵罐中通空气维持微氧条件，考察不同的通气量和 pH 值对发酵过程的影响，定期取样分析菌体浓度、葡萄糖浓度，样品离心后经气相色谱和高效液相色谱分析各产物含量，培养10 12 h，葡萄糖消耗尽时结束发酵。1. 2. 3 分析方法62010 Vol. 36 No. 8( Total 272) 研究报告图 1微氧条件下 K. pneumoniae 代谢葡萄糖产 2，3-丁二醇的途径葡萄糖采用葡萄糖分析仪测定; 菌体浓度以波长2结果与讨论650 nm 下的光密度( OD 值) 表示; 2，3-丁二醇、乙偶姻和乙醇浓度用气相色谱法检测，色谱柱( 5 mm 22.

8、 1不同通气量对发酵过程的影响m) 填料为 Chromsorb 101，柱温 190 ，汽化室与检测以浓度约为 50 g /L 葡萄糖为底物，在 37 、pH器温度均为 200 ，载气为 N2 ，流速 50 mL /min，进样值 5. 5 条件下，考察了不同通气量对发酵过程的影量 1 L，采用外标法定量; 发酵液中有机酸( 琥珀酸、响，实验结果如图 2 和图 3 所示。9。甲酸、乙酸) 采用高效液相色谱法检测cBD + AC 为 2，3-丁二醇和乙偶姻浓度之和; cEthanol 和 cGlucose 分别为乙醇和葡萄糖浓度;c Succinate 、cFormate 和 cAcetate

9、分别为琥珀酸、甲酸和乙酸浓度图 2 不同通气量对主要产物形成、底物消耗和菌体生长的影响从图 2 可知，通气量越大，菌体生长越迅速，发酵8 h，通气量为 0. 12 vvm 时的 OD650 nm 已经达到 8. 88，2010 年第 36 卷第 8 期( 总第 272 期)7食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES而通气量越大，副产物乙醇的浓度越低，当通气量为葡萄糖含量较低，导致部分有机酸被微生物细胞利用0. 12 vvm，乙醇终浓度仅为 4. 86g /L，而通气量为以维持自身生长，另有部分有机酸则被微生物代谢分0. 04 vvm 时乙醇终浓度可达 6.

10、 57g /L。由于菌体内解而造成了发酵后期有机酸含量的下降，而此时生物不同产物代谢途径需氧不尽相同，发酵过程中通气量量及主产物 2，3-丁二醇基本不变，乙酸浓度却有所过大，溶液中溶氧浓度高会造成葡萄糖的主要代谢物回升，这可能是其它有机酸代谢转化为乙酸的结果。为生物量和 CO2 ，而使糖的转化效率降低; 而通气量从实验结果可知，通气量越大，越有利于乙酸和甲酸10。的形成，当通气量为 0. 12 vvm 甲酸最高浓度可达过低，代谢向乙醇、乳酸等需氧更少的途径偏移从本实验结果来看，当通气量为 0. 10 vvm 时，目标产0. 59 g /L，乙酸最高浓度可达 0. 32 g /L，而通气量为物的

11、质量浓度和积累速度都是最高的，在发酵第 9 h，0. 04 vvm 时甲酸最高浓度仅为 0. 21 g /L，乙酸最高2，3-丁二醇与乙偶姻浓度之和达 16. 16g /L，产物得浓度为 0. 27 g /L。通气量越小，琥珀酸的浓度越高，率为 0. 32 g /g 葡萄糖，生产强度为 1. 80g / ( Lh) ，当通气量为 0. 04 vvm 琥珀酸最高浓度可达 1. 94 g /因此，选择通气量为 0. 10 vvm 较合适。L，而在通气量为 0. 12 vvm 时，最高琥珀酸浓度为对不同通气量条件下发酵过程中产生的有机酸1. 69 g /L。这可能是由于在 K. pneumoniae

12、 代谢过程进行了分析( 图 3) ，可以看出，随着发酵的进行，甲酸中，每形成 1 mol 琥珀酸，就需要 1 mol 的 CO2 ，通气和琥珀酸的浓度逐渐增加，而乙酸浓度的变化趋势是量越大，发酵体系中可利用的 CO2 随着尾气被排出先增加，然后降低。在发酵后期甲酸和琥珀酸含量均发酵罐速度越快，使生物合成琥珀酸所必需的 CO2有不同程度的下降，主要原因可能是此时培养基中的量减少，从而不利于琥珀酸的形成。图 3通气量对有机酸形成的影响2. 2不同 pH 值对发酵过程的影响量为 0. 10 vvm 条件下，考察了不同 pH 值对发酵过程以浓度约为 50 g /L 葡萄糖为底物，在 37 、通气的影响

13、，实验结果如图 4 和图 5 所示。图 4不同 pH 值对主要产物形成、底物消耗和菌体生长的影响82010 Vol. 36 No. 8( Total 272) 研究报告从图 4 可知，在本实验所考察的范围内，pH 值越成 2，3-丁二醇的第 1 个关键酶乙酰乳酸合成酶的活高，菌体的浓度越高。从图 4 还可以看出，在 pH 为性最高，且另外 2 种关键酶( 乙酰乳酸脱羧酶和乙偶5.0 时，可获得最高浓度的副产物乙醇，为 7. 41 g /L，姻还原酶) 在 pH 值 5. 8 时也能保持相对较高的活而当 pH 值为 5. 8 时，乙醇生成量相对较少，最高浓性，因此，结合本研究结果，选择 pH 值

14、为 5. 8 较合度为 5. 25g /L。从底物消耗的情况来看，当 pH 值为适。5.8 时，葡萄糖消耗速率最快。本实验中，当 pH 值为对不同 pH 值条件下发酵过程中产生的有机酸5.8 时目标产物的质量浓度和转化率均高于其他 pH进行了分析( 图 5) ，从实验结果可知，pH 值越大，越值，在发酵第 8 h，2，3-丁二醇与乙偶姻之和为有利于琥珀酸的形成，当 pH 值为 6. 0、发酵 9 h 时，15. 76 g /L，产物得率为 0. 32 g /g 葡萄糖，生产强度为琥珀酸达到了其最高浓度，为 1. 99 g /L，在发酵后期1.97 g / ( Lh) 。随着发酵的进行，在发酵后

15、期，目标琥珀酸的浓度也有所降低。当 pH 值为 5. 8 时，甲酸产物浓度有所下降，这可能是由于此时葡萄糖已经被可以获得的最高浓度为 0. 91 g /L，而在 pH 值 5. 0完全耗尽，微生物则利用 2，3-丁二醇作为底物，将其时，甲酸在发酵过程中的浓度始终保持较低的水平。代谢分解，而造成了在发酵后期产物浓度的下降。乙酸在 pH 值为 6. 0 可获得最高浓度为 0. 45 g /L，而11 12在研究中发现，在 pH 值为 5. 8 时，合在 pH 为 5. 0 最高浓度为 0. 28 g /L。Stormer 等图 5不同 pH 值对有机酸形成的影响2. 3 K. pneumoniae

16、 CICC 10011 发酵制备 2，3-丁二醇过程中产物的变化规律在上述实验中发现，在不同的通气量或 pH 条件下的发酵，底物消耗、菌体生长以及各产物的变化都有着类似的规律，在通气量 0. 10 vvm、pH5. 8 条件下，最有利于 2，3-丁二醇的发酵，因而以此为例，分析发酵过程中细胞生长和各产物形成情况，如图 6 所示。将 K. pneumoniae CICC 10011 代谢葡萄糖的间歇发酵分为 4 个阶段，第 1 阶段从 0 2 h，这个阶段为发酵的初始阶段，菌体处于延滞期，OD 值增加缓慢，葡萄糖消耗也较慢，但副产物乙酸在此阶段迅速积累并 qAcetate 达到最高值为 3. 9

17、8 mmol / ( gh) ，除乙酸外，其他产物积累量很少。第 2 阶段从 2 6 h，这段时期进入细胞对数生长期，菌体生长迅速，葡萄糖的消耗速率明显增加，除乙酸外的其它产物也迅速积累，qGlucose 、q2，3-BD 、qEthanol 、qSuccinate 和 qFormate 所达到的最大值分别为 19. 61 mmol / ( gh) 、9. 12 mmol / ( gh) 、7. 76 mmol / ( g h ) 、1. 97 mmol / ( g h ) 和 1. 22 mmol / ( gh) 。值得注意的是，乙酸的比生成速率在q Glucose 为葡萄糖比消耗速率; q

18、2，3-BD 、qEthanol 、qSuccinate 、qFormate和 qAcetate 分别为 2，3-丁二醇、乙醇、琥珀酸、甲酸和乙酸比生成速率图 6 批式发酵中细胞生长和代谢流量的变化情况2010 年第 36 卷第 8 期( 总第 272 期)9食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES这个阶段出现了负值，也就意味着前期所形成的乙酸在此阶段作为底物转化成了其它物质。第 3 阶段为6 8 h，在这段时期，菌体浓度增加变缓，q2，3-BD 和 qEthanol 也随之下降，而 qAcetate 却逐渐增加。第 4 阶段为8 9 h 发酵末期，此阶段

19、葡萄糖已经基本消耗完全，因此有机酸被作为碳源而利用，有着不同程度的浓度降低现象。由于底物耗尽，细胞停止生长，菌体浓度开始下降，产物合成也基本停止。从图 6 可以明显看出，乙酸的形成要早于其它有机酸的合成，也早于目标产物 2，3-丁二醇和乙偶姻13的合成。Zheng 等在利用 K. pneumoniae CGMCC1. 636 6 代谢甘油生产 1，3-丙二醇的研究中也类似的发现，在所有代谢产物中，乙酸是最早形成的。从克雷伯氏菌代谢葡萄糖的途径( 图 1) 可以看出，乙酸的产生伴随有 ATP 生成，这将为后续的发酵过程提供更多的能量; 另一方面，乙酸的早期合成也十分有利于目标产物 2，3-丁二醇

20、的合成。据文献报道，乙酸能够激活 2，3-丁二醇合成途径中的 3 种关键11 12，因此有学者在发酵 2，3-丁二醇的研究中添酶加乙酸以期提高 2，3-丁二醇的浓度和转化率。Yu 和14，3-Saddler 在研究中发现，在 K. pneumoniae 发酵 2丁二醇初期添加适量的乙酸有利于 2，3-丁二醇的积累和底物的充分利用，当添加乙酸量为 0. 5% ( ) 时是最合适的，与未添加乙酸的对照组相比，2，3-丁二醇产量提高了近 3 倍，同时菌体浓度也有明显提高，所添加的乙酸在发酵过程中被利用，但当添加的乙酸量超过 2% ( ) 时就可完全抑制细胞生长。Nakashi-15在 Paeniba

21、cillus polymyxa 发酵 2，3-丁二醇mada 等的研究中也发现，添加适量的乙酸，可以提高产物 2，3-丁二醇的产量和葡萄糖转化率，且乙酸与葡萄糖消耗的摩尔比为 0. 35 mol /mol。比较不同通气条件下第一阶段乙酸的比生成速率可知，O2 对乙酸的比生成速率有明显影响。在 pH 值 5. 5、0. 08 vvm 时，乙酸的比生成速率最大，达到 4 mmol / ( gh) 。而通气量为 0. 1vvm、pH 值 5. 8 6. 0时乙酸的比生成速率最大亦为 4 mmol / ( gh) ，此时2，3-丁二醇的比生成速率亦相应达到最大值。从这些数据可推断出，此菌株发酵生产 2

22、，3-丁二醇时乙酸的比生成速率临界值为 4 mmol / ( gh) 。综合通气量和 pH 对 2，3-丁二醇发酵的影响可看出，合理的 2，3-丁二醇发酵控制策略应该是同时控制通气量和 pH 值，而不是采取恒定的发酵条件。在发酵前期，采用高通气量和高 pH 值，有利于菌体生长和乙酸生成。一旦乙酸的浓度累积到足以诱导2，3-丁二醇代谢途径关键酶，则应降低通气量和 pH 使菌体内糖代谢向 2，3-丁二醇途径偏移，从而提高16利用 K. oxytoca 代谢葡2，3-丁二醇的产量。Ji 等萄糖产 2，3-丁二醇，采用 2 段搅拌方式改变溶液中溶氧，使发酵液中 2，3-丁二醇浓度、转化率和生产强度分别

23、提高了 6. 23% ，6. 22% 和 22. 14% 。由此可见，依据菌种的代谢特性采取适当的控制策略，就可以提高 2，3-丁二醇的产量。3结论( 1) 对 K. pneumoniae CICC 10011 批式发酵制备 2，3-丁二醇的条件进行了研究，确定了发酵 2，3-丁二醇的最适通气量为 0. 10 vvm，最适 pH 值为 5. 8。( 2) 对发酵过程中细胞生长和主要代谢产物的形成进行了分析，发现在细胞生长延滞期快速积累乙酸，而在细胞对数生长期大量积累 2，3-丁二醇、有机酸，并消耗乙酸; 当细胞生长进入静止期后，产生的2，3-丁二醇减少，消耗有机酸的同时增加了乙酸的形成。( 3

24、) 根据 K. pneumoniae 的代谢途径并结合以往报道分析表明，早期乙酸的形成有利于目标产物 2，3-丁二醇的积累。调节底物浓度、通气量和 pH 值，使细胞尽早产生足够的乙酸，维持较长的对数生长期是发酵生产 2，3-丁二醇的关键。参考文献1Garg S K，Jain A. Fermentative production of 2，3-butane-diol: A reviewJ. Bioresour Technol，1995，51: 103 109.2纪晓俊，朱建国，高振，等 . 微生物发酵法生产 2，3-丁二醇的研究进展J. 现代化工，2006，26( 8) : 23 27.3Syu

25、 MJ. Biological production of 2，3-butanediol J. Ap-pl Microbiol Biotechnol，2001，55( 1) : 10 18.4Sun L H，Wang X D，Dai J Y，et al. Microbial productionof 2，3-butanediol from Jerusalem artichoke tubers by Kleb-siella pneumoniaeJ. Appl Microbiol Biotechnol，2009，82( 5) : 847 852.5 张江红，孙丽慧，修志龙 . 2，3-丁二醇发酵液

26、的絮凝除菌与絮凝细胞的循环利用J. 过程工程学报，2008，8( 4) : 779 783.6Zeng A P，Byun T G，Possten C，et al. Use of respiratory quotient as a control parameter for optimum oxygen supply and scale-up of 2，3-butanediol production under microaero- 10 2010 Vol. 36 No. 8( Total 272) 研究报告bic conditions J. Biotechnol Bioeng，1994，44

27、( 9 ) :12Stormer FC. Evidence for induction of the 2，3-butanediol-1 107 1 114.forming enzymes in Aerobacter aerogenesJ. FEBS Lett，7Ma C Q，Wang A L，Qin J Y，et al. Enhanced 2，3-bu-1968，2( 1) : 36 38.tanediol production by Klebsiella pneumoniae SDMJ.13 Zheng Z M，Xu Y Z，Liu H J，et al. Physiologic mecha-

28、Appl Microbiol Biotechnol，2009，82( 1) : 49 57.nisms of sequential products synthesis in 1，3-propanediol8 Qin J Y，Xiao Z J，Ma C Q，et al. Production of 2，3-bu-fed-batch fermentation by Klebsiella pneumoniaeJ. Bio-tanediol by Klebsiella pneumoniae using glucose and ammo-technol Bioeng，2008，100( 5) : 92

29、3 932.nium phosphate J. Chin J Chem Eng，2006，14 ( 1) :14Yu E K，Saddker J N. Fed-batch approach to production132 136.of 2，3-butanediol by Klebsiella pneumoniae grown on high9 王元好，董悦生，修志龙，等 . 梯度洗脱高效液相色谱法substrate concentrations J. Appl Environ Microb，快速测定 1，3-丙二醇发酵液有机酸J. 食品与发酵工1983，46( 3) : 630 635.业，

30、2010，36( 1) : 126 130.15 Nakashimada Y，Marwoto B，Kashiwamura T，et al. En-10 Celinska E，Grajek W. Biotechnological production of 2，hanced 2，3-butanediol production by addition of acetic3-butanediol -current state and prospects J. Biotechnolacid in Paenibacillus polymyxa J. J Biosci Bioeng，Adv，2009，27

31、( 6) : 715 725.2000，90( 6) : 661 664.11Larsen S H，Stormer FC. Diacetyl ( acetoin) reductase16 Ji X J，Huang H，Du J，et al. Enhanced 2，3-butanediolfrom Aerobacter aerogenes kinetic mechanism and regula-production by Klebsiella oxytoca using a two-stage agitationtion by acetate of the reversible reducti

32、on of acetoin to 2，speed control strategy J. Bioresour Technol，2009，3-butanediol J. Eur J Biochem，1973，34( 1) : 100 100( 13) : 3 410 3 414.106.Effects of Fermentation Conditions on Metabolism of Klebsiella pneumoniae Producing 2，3-ButanediolSun Li-hui，Dai Jian-ying，Wang Xu-dong，Xiu Zhi-long( School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，D