纤维素乙醇酵母菌种选育的研究进展

1、纤维素乙醇酵母菌种选育的研究进展*张作阳田 沈 闫 飞 杨秀山*（首都师范大学 生命科学学院，北京100037）摘 要 以木质纤维素为原料生产燃料乙醇成为国内外研究的热点。能够高效代谢木质纤维素稀酸水解液中的可发酵糖，同时可耐受/分解发酵抑制剂的菌种成为木质纤维素制取燃料乙醇的技术瓶颈之一。酵母菌是工业生产的优良菌种，多年来人们通过各种手段对其改进，使其能用于纤维素乙醇的生产。本文介绍了木质纤维素水解液乙醇发酵酵母菌种选育的研究进展。关键词 酵母菌，乙醇，育种技术，木质纤维素水解液CLCPROGRESS OF STRAINS BREEDING FOR FERMENTATION OFLIGNOC

2、ELLULOSE HYDROLYSATESZHANG Zuo-Yang, YANG Xiu-Shan*, TIAN Shen & YAN Fei(College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037)Abstract The researches of using lignocellulose as material produce ethanol has been hot through out the world. Strains which can use the saccharide in lignocel

3、lulosic hydrolysates, and can tolerant or metabolize inhibitors at the same time is one of the restrictions which limit the development of fermenting lignocellulose into ethanol. Yeasts are excellent strains for industry fermentation, researchers used many methods to improved its performance many ye

4、ars ago to make it used in producing ethanol from lignocellulosic. This review introduced the progress in the strains breeding for ethanol fermentation by lignocellulose hydrolysates. Key words yeast; ethanol; strains breeding; lignocellulosic hydrolysates随着人类对石油等资源的大量开采和生存环境的不断恶化，能源和环境问题已经成为困扰人类的重大

5、难题。因此，许多国家纷纷加入了开发清洁、可再生能源的行列，同时把目光投向地球上丰富的生物质资源。以生物质为原料生产乙醇替代石油等成为当前研究的热点。近年来欧盟提出，2005 年至 2010 年使用生物质燃料替代车用燃料消耗量达到 2%到 5.75%1，美国、巴西、欧盟的农业政策开始向新兴的乙醇工业倾斜。目前，生产燃料乙醇的原料主要包括甜蜜类、谷物淀粉类和纤维素类。木质纤维素，作为地球上最丰富、廉价的再生资源，为燃料乙醇工业的发展带来了新的希望。可用于木质纤维素乙醇发酵的微生物包括很多种类，细菌(如: Zymomonas.mobilis)，丝状真菌及酵母属的多种酵母菌。其中，酵母的应用最为广泛。

6、酵母菌是工业上生产乙醇的优良菌株，与其他微生物相比，具有乙醇耐受力高、发酵速度快、发酵过程不易污染、副产物少等优势，因此成为育种的首选对象。1 木质纤维素稀酸水解液发酵乙醇的菌种问题木质纤维素主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素。经过稀酸、酶解等预处理后，纤维素转化为六碳糖（主要为葡萄糖）；半纤维素转化为五碳糖（主要为木糖），木糖的含量可达30%。木质纤维素经过收稿日期 Received: 2008-11-，接受日期 Accepted: 2008-11-基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）课题资助项目(No.2002AA514010，No.2001AA514024)，中青年骨干教师资

7、助项目，北京市优秀人才资助项目Supported by the Ministry of Science and Technology, China(No.2002AA514010，No.2001AA514024), *通讯作者 Corresponding author (Tel:, E-mail: cnu_)稀酸水解可得到以葡萄糖和木糖为主的可发酵糖，同时在水解过程中也产生了抑制微生物生长和代谢的毒性物质，称为发酵抑制剂，包括糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物等化合物2。其中，糠醛和羟甲基糠醛是最为主要的抑制因子，它们的产生分别是由于六碳糖

8、和五碳糖的降解作用造成的。除了降低乙醇发酵产率和细胞生长外，它们的存在还会延长延滞期、抑制酶活性3 。采用简便、高效、经济的方法去除或减少木质纤维素水解糖液中的毒性物质，对于提高微生物的乙醇转化效率具有重要意义。用理化和生物法可有效去除或部分去除稀酸水解糖液中的毒性物质，如活性炭吸附、煮沸、碱处理、离子交换吸附、酶处理等。但这些方法无疑都会增加木质纤维素制乙醇的成本。因此，以木质纤维素为原料生产燃料乙醇亟待解决的基础生物学问题之一，是获得耐受水解液中毒性物质并能够进行高效乙醇发酵的微生物菌种。酵母菌虽然与其它菌种相比在工业生产上具有较明显的优势，但也有自身的不足：一些种属对抑制物具有较强的耐受

9、性并且可以转化并利用一些毒性物质，但其不能利用木糖。分析表明，充分利用木质纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇能使乙醇产量在原有基础上提高254。而自然界中存在的少数几种野生型酵母能较好的利用木糖产生乙醇，但其对抑制物的耐受能力均不强。因此，通过育种获得耐受水解液毒性并能够进行高效乙醇发酵的微生物菌种，对于降低成本、简化流程、最大程度的利用资源至关重要。2 解决菌种问题的策略2.1 传统方法自然界中的菌种没有经过任何人工处理，依靠自发突变改进自身性能，因此性能稳定，有极大的改进和利用价值。依靠自然选育，Nilsson3等得到一株酿酒酵母（TMB3000）具有良好的水解液耐受性，在批式发酵中还原糠醛的

10、能力比酵母CBS8066高三倍，同时还表现出了还原羟甲基糠醛的能力。驯化，对于提高菌种对木质纤维素水解液中抑制剂的耐受性，及乙醇发酵能力是一种安全、有效的手段。陈艳萍5通过对树干毕赤酵母长期驯化和定向培育得到一株菌P2，此菌能发酵戊糖和己糖，对发酵抑制物有较强的耐受力，在低酵母浓度、低pH下，该酵母对糖的利用率及发酵后酒精得率均较高。Nigam6利用不同浓度的硬木硫酸水解糖液对树干毕赤酵母进行连续驯化，极大的提高了其乙醇发酵能力，最大乙醇产率达0.41 g/g。Frank K. 7等利用玉米秸秆稀酸水解液液体和加琼脂的固体对树干毕赤酵母进行驯化，显著提高了糖的利用率和乙醇产率。方波8等将树干毕

11、赤酵母置于木质纤维素水解液浓度递增的培养基中传代培养，使酵母的乙醇产量、总糖转化率、菌体存活率均得到提高。诱变不仅可以应用于天然的菌株，也可以应用于一些经过分子手段改造的菌种。Wahlbom 2等将染色体重组酿酒酵母TMB3399经化学诱变得到了突变株TBM3400。在限氧条件下其乙醇产率达到了0.25 g 乙醇/g 木糖, 且木糖还原酶和酮糖激酶的活性都高于TMB3399。2.2 基因工程方法随着现代基因工程技术的不断发展，从遗传物质和代谢途径上对工业菌株进行改造已成为广泛应用的菌种改良方法。一些酿酒酵母不论乙醇的发酵能力、毒性物质的耐受/代谢能力、发酵速率等方面都远优于其它菌种，是遗传改造

12、的主要对象。研究者通过对其代谢途径的改造，在酿酒酵母中克隆表达天然利用木糖酵母的基因，引入木糖向木酮糖转化的途径，使酿酒酵母可以利用木糖，并提高相应酶的表达量，从而提高乙醇产量。通过敲除6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（ZWF1）或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因（GDN1），同时超表达外源XYL1、XYL2及自身的木酮糖激酶基因（XKS1），Jeppson M. 9等分别构建了重组酿酒酵母TMB3255和TMB3008，其乙醇产率均显著提高，其中TMB3255最高乙醇产量达0.41 g/g。Kuyper等10将一种厌氧真菌Piromyces sp. E2的木糖异构酶基因XYLA在酿酒酵母中高水平活性表达，

13、之后对获得的重组菌进行进化工程改造，获得了能在木糖上厌氧生长并产乙醇的菌株RWB-202-AFX11。而后，Kuyper等12又将该菌从木糖转化到糖酵解中间产物所需的全部基因均过量表达，同时敲除醛糖还原酶基因GRE3，得到重组菌RWB217，其利用木糖产乙醇能力可达0.43 g/g，乙醇产生速度达到0.46 g/gh。Karhumaa等13,14构建的重组酿酒酵母TMB3050和TMB3057，都在表达P. stipitis的XYL1、XYL2基础上过表达TKL1、TAL1和XKS1，它们的过表达明显增加了重组菌在木糖上生长的速度和乙醇产量。2.3 原生质体融合的方法原生质体融合技术受接合型，

14、致育性限制小，具有重组频率高，遗传物质传递完善等特点，打破了种间隔离，易获得性状优良的菌株，被广泛的应用于育种中。Kordowska15得到的树干毕赤酵母和酿酒酵母的融合子，其能力介于亲本之间。Dziuba E. 16以酿酒酵母（D43）与休哈塔假丝酵母（ATCC 58779），嗜鞣管囊酵母（ATCC 32691 和 ATCC 60392）进行了原生质体融合，融合子 120 h 能完成对木糖的发酵。 Chmielewska J17获得了酿酒酵母（D43）与毕赤酵母（ATCC 58376）的属间融合子，融合子发酵木糖产酒精的量与亲株毕赤酵母（0.389 g/g）相当，但木糖醇的产量要比亲株低 4

15、0 %多。并且木糖发酵的周期由 10 天缩短至 7 天。发酵葡萄糖和木糖 7:3 的混合糖时，7 天后乙醇产量达到 0.377 g/g。钟桂芳18等通过属间融合获得了休哈塔假丝酵母和耐高温酿酒酵母的融合子。融合子能在 45 下发酵木糖生产乙醇，在兼性厌氧条件下发酵混合糖的能力优于亲株，且乙醇耐受能力比亲株提高了 1 %。C. Pasha19等将酿酒酵母与休哈塔假丝酵母进行电融合，而后对融合子进行诱变，从中筛选出一株菌 CP11，该菌可以稳定的发酵木质纤维素稀酸水解液。我研究组以酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母为亲本进行融合，得到融合子 F1，其木糖发酵乙醇产量为 0.062 g/g，是嗜鞣管囊酵母亲株的

16、 2.8 倍，混合糖发酵乙醇产量可达到 9.52 g/L。2.4 其他方法目前已被科研工作者开发和应用的育种手段还有如代谢工程，进化工程（如DNA改组，基因组改组）等都在微生物育种中得到了广泛的应用。代谢工程手段对酵母菌的木糖代谢改造主要集中在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，菌种改造涉及木糖跨膜运输、吸收利用、磷酸戊糖途径、糖酵解及胞内氧化还原状态的维持等多个方面20。张凌燕21等以C. tropicalis CICIM Y0092为出发菌株，采用代谢工程育种策略，增加细胞内木糖醇脱氢酶的表达量, 使代谢流流向乙醇形成方向，以提高酒精产量。发酵试验表明重组菌株C

17、. tropicalis XYL2-7的中间代谢产物木糖醇积累明显减少了，木糖醇的得率降低了70 %，同时乙醇产量有了一定的提高。而进化工程技术虽然也有应用于酵母菌选育，但纤维素乙醇菌种的选育报道较少。无论如何这些技术的出现都为纤维素乙醇菌种选育提供了新的方向。3 总结与展望以木质纤维素原料水解液发酵生产乙醇是解决能源和环境问题的经济环保有效的途径，而能否得到代谢木糖且耐受发酵抑制物质的菌种则是纤维素乙醇产业化的关键之一。科研工作者尝试用驯化、诱变等传统方法和基因工程、细胞工程、代谢工程等现代分子细胞手段对酵母菌进行改造，也取得了一定的成果。虽然多数菌种在实际应用中还存在着一些问题，但相信随着

18、研究的深入，会有性能更优良的菌种应用于燃料乙醇的生产。参考文献1 Roca C, O lsson L. Increasing ethanol productivity during xylose fermentat ion by cell recycling of recombinant Saccharom y ces cerev isiae . Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 60: 5605632 Wahlbom C F, van ZylW H, Jonsson L J , et al. Generation of the improved recombi

19、nant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiaeTMB 3400 by random mutagenesis and physiological comparison with Pichia stipitis CBS6054 . FEMS Yeast Research, 2003, 3: 319 326.3 Nilsson A , Go rw a2Grauslund M , Hahn2Hagerdal B, et al. Cofactor dependence in Furan reduction bySaccharomy cescerevisiae

20、 in fermentation of acid-hydrolyzed lignocellulose . Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71:78667871.4 Nigam J N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicelluose and prehycrolysate. J Appl Microbiol, 2001, 90(2) : 20

21、8215.5陈艳萍. 树干毕赤酵母戊糖发酵的研究 D.南京林业大学化学工程学院, 2000.6JN Nigam Ethanol production from hardwood spent sulfite liquor using an adapted strain of Pichia stipitis Journal of industrial Microbiology & Biotechnology 2001, 26: 1451507Frank K. Agbogbo, Frank D. Haagensen, David MilamFermentation of Acid-pretreate

22、d Corn Stover to Ethanol WithoutDetoxification Using Pichia stipitisApplied Biochemistry and Biotechnololy 2008,145:53588方波, 史萍, 许学书, 环境应激下Pichia stipitis 酵母形态性能与蛋白的差异 华东理工大学学报(自然科学版) 2007 33(5):6476519Jeppson M, Johansson B, Hahn-Hagerdal B, et al. Reduced oxidative pentose phosphate pathway flux i

23、n recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains improves the ethanol yield from xylose. J Appl Environ Microbiol, 2002, 68: 16041609.10Kuyper M, Harhangi H R, Stave A K, et al. High-level functional expression of a fungal xylose isomerase： the key to efficientethanolic fermentation o

24、f xylose by Saccharomyces cerevisiae? J FEMS Yeast Res, 2003, 4：6978.11 Kuyper M, Hartog M M, Toirkens M J, et al. Metabolic engineering of a xylose isomerase expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xylose fermentation. J FEMS Yeast Res,2005, 5: 399409.12Kuyper M, Winkler A A,

25、 VanDijken J P, et al. Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle. J FEMS Yeast Res, 2004, 4: 655664.13Karhumaa K, Hahn-Hagerdal B, Gorwa-Grauslund MF. Investigation of limiting metabolic steps in the utilization of xyl

26、ose by recombinant Saccharomyces cerevisiae using metabolic engineering. J Yeast 2005, 22：359368.14 Karhumaa K, Fromanger R, Hahn-Hagerdal B, et al. High activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase improves xylose fermentation by recombinant Sacchromyces cerevisae. J Appl Microbial Biotechnol, 2007, 73：10391046.15Kordowska W M,Targonski Z. Application