高效液相色谱法用于那格列奈质量控制的研究_张哲峰

1、药物分析杂志C ih n半衰期约为 6 . 7 m in , 在血浆中为 1 . 3 m ni 团 , 故本实验所有操作均在暗室中严格避光进行。参考文献1功 M吨一 腼g ( 吕鸣芳 ) , IJA N G ew n 一 d。 ( 江文 德 ) . P h - n e it c . fo n ios lid p ine i m 卯tr 曰 in C腼es h司山 y v o lun t ( 进 口 尼索地平在中国人的人体药代动力学研究 ) . C知阮 J a 认 尸八山” . 川( 中国临床药理学杂志 ) , 1 9 6 , 1(2 )2 : 39J Ph n 吐 2 (X抖 ,24 ( )2

2、1 2 92JapvanH a tr e n , P e t e rnavBe le n , M i e 抽d几 M L 川we ij ks, 以.P 抽叮叨加k i n e 石cs and h e m 仪mrUb田in c e 肠ec st of苗即1山p ine二d 池 i -nt e r act i o n 衍htc i m e t i d nie.口认 月钻而瓜沈以 刀认r用ar 凡h , 91 8, 43( 3 ) :3 333V na H a d e D J , L 叮巧咧 skM hT M , V na Be le n P , 以 aL G ase h价m 川叩” p抽cd e

3、t e 面n 如 nofo 垃即ld ip in e narnud no e fo iet m e 倒比il estnip l朋am . J 以卯价川勿犷 , 9178 , 24 3 ( 2 ) : 372( 本文 于 2 )(X 3 年 5 月 8 日收到 )高效液相色谱法用于那格列奈质量控制 的研究张哲峰, ,2杨更亮, *3, 周 宇 陈 义,( 1 . 河北大学化学与环境学院 河北省分析科学重点实验室 保定 7a 1X() 2 ;2 . 河北省药品检验所 石家庄 050 1 1 ; 3 . 中国科学院化学所分子科学中心 北京 1侧X) 8 0)摘要 目的 : 建立那格列奈对映体、 有关

4、物质及含量测定的 Hr L C 分析法。 方法 : 采用 oA 一 3 0 手性柱 ( 25 0 x 4 . 6 , 5 卿) , 柱温 30 , 以 0 . 0 25 m o l L 一 醋酸按的甲醇溶液为流动相 , 2 10 恤 检测 , 分离对映体 ; uL N A o Ds 柱 ( 25 0 x4 . 6 ,5 卿) , 乙腊 一 甲醇 一 0 . l lomL 一 的磷酸二氢按( 5: :24 , 用磷酸调 p H 3 . )0为流动相 , Z 01 rnu 检测 , 用 于有关物质及含量测定。结果 : D 、 L 异构体分离度 3 . 0 以上 , 最低检出限分别为 0 . 80

5、和 0 . 21 ng ; 顺反异构体及各中间体在 02 面n 内较好分离 , 线性关系良好 ,最低检出限 0 . 62 gn 以下。 结论 : 方法简便、 快速、 准确 , 两色谱系统结合 , 分别用于检测光学纯度、 有关物质及含量, 可在较高水平上控制本品质量。关健词 那格列奈 对映异构体 顺反异构体 手性分离 有关物质St ud yo ntheQu aU ty Co nt rfoofNate沙uldeb y H P L C(z H A N G Zh e 一 fen g l ,2 , AY N e G七n g 一 li an g l , 3 ”, 服o u Y u lna d e 现N 砚

6、 3rof肠 佃 of汕勺记 .声昭 70从汉1.止卯乙公“肠脚湘形目 &汤几 以 说” . 了翻成1侧)2 ;2.阮乃阶 留力“目“妞肠弘乒叻翻绍 050袅for阮山反。fohe涌勺hc苗山衅 fo反。 声乒喀so)D n 心川功止,11 ;3几妞 r翔ro r众, 乃.自“ “C,月众e1峨洲X)ar,坷 ve oTabtLP.tra 鳍 and d e t e n n i n i n g ht ean,南and 忿r a 刀店 -A b s tc to伙柱 :e sli s h HC m e th o d s fo res Pie nit o m e sr一i so m e srer l

7、a te d su b s atn e e s an d e o n t e nto f n tea gh n i d eM e 山侧如 : 仆ee h ro m a t o g 旧P ih ee o dn i t i o nfo ht ee n an it o m esrs叩肛a t io n : o A 一 3 3 0 ( 2 50x 4 .61,5 脚) 。 o lu mn , a 0 . 02 5 m loL 一 o 址 mu ca e山i n me 山aonl sol u -isab i l户sa .htn wo tra0 m L而thlmUetepra to resa3 0 d e

8、ctonavto nm oemne ,ehornuernt.n一,e e onmmawattea,et iwe -肿 saw.,toa,.atn一。ULl e nnu2 10mrnT卜e emg旧p h i ee o n d i t i o no f th e er l ta des ubse e snade o n t e n t)d e te rm i n a ti o n :N A O D S(2 5 0x465卿)eol umnae e otinitr l e一mehty lalchool一 01omlL(N H4HZOP (5 , 2 :4) ( jdaus tdeethgttoP

9、H.3 .0衍th8 5 % 户 0 5 油o ir eca i d ) sam ob i lep hesaed,ht e lowar te na d ht e de ti now vaele nanwasht esolsa.hToul.be印tra面.atZ.a ob v eR es ultS:ewt oe n a n t i o m e 玲 eds衍n 1 2m i n ute s w iht ou t edir v at iio nd hteersameut i o nw a s 目x v e3 0 Th e d et e ti o nil m istew re0 0 8 n g of

10、r D 一 an d 01 2 吧 forL 一 e n na t i o m e r , re s p e c ti v e ylTh e fieve o m op u n d s ,e is 一 an d rta。 一 isomta e g l i n id e ,.一 an d如ns 一 i soesr,esrofnesimofi so p or p y le y e l o h e x y lc ar b iecai d D一p h e yln lanai n e e o ul d eb s e p田旧et d袱ht i n02 m i n u t e sTh es 切 Ln d 耐

11、es fo hetif v ee o m 卯u n d sw e erg 以对 l in e ra叨d ht e d at ec it o n l i m iste ma e to bel o w o .6 2 n g .C o cn lu 幼o n :T七eed v reuvelo P de m e htod s h a v eht e da v an 恤罗sfo si 呷el ,Pra i d na d ac e u r a te ,an d e luo d beu s edforqU al i yt e o n DIt I fo ht ee h i r alp硕ty ,e is一 i s

12、o m er ,re l tea d s u b s atn e e s na dc o nte n t fOn a te 幼n i de .K e y w o n 如n ta 喀i n i d e , e n an ti o m re,e is一 an d atr 。 一 i os m re , e h i rla eS p ar ti o n , elr a t de s u b s t na e e s* 国家自然科学基金资助项 目( 2 )(X 7 5 )(X 5 ) 和河北省自然科学基金资助项 目( 2 1 刀 7 )* 通讯联系人 ( 即 即。 d i n g ua ht o r

13、)药物分析杂志那格列奈是国内正在研究中的一种新型 降糖药物 , 国外近年作为“ 餐时血糖调节剂” 用于 n 型糖尿病的治疗 。 本品化学名称 N 一 ( 反式 一 4 一 异丙基环己基 一 碳基 ) 一 D 一 苯丙氨酸 ( 图 1 ) , 分子中含一手性碳原子和一带有 2 个不同取代基的环己烷结构 , 既有光学异构体同时还有顺反异构体。厂一入a( c 3H , ” 一 人一广一C一图 1 那格列奈化学结构式Fi g1C healrtus e t u 花 Of n aet 砂 in de研究表明 , 本 品 刀 一 异构体药理活性约为 L - 异构体的 06 倍2 , 反式 D 一 异构体具有

14、较强的降血糖作用 , 作为药用形式闭 。 故质量标准中应对其顺式异构体及 L 一 异构体进行控制 , 以确保其临床应用安全有效。 曾有文献报道用 L 一 氨基酸手性柱正相 H p L C 法 及柱前衍生手性 H p L C 法阎 分离其对映体 , 未见本品与各中间体分离 的报道。 本文以反相色谱法在 O A 一 3 0 手性柱上直接分离其对 映体 , 并用一套色谱系统 , 在 O D S 柱上于 02 m ni 内同时分离其顺反异构体及各中间体。1 仪器与试剂日本岛津 L C 一 01A D 型泵 , S DP一 10 A 型紫外一可见检测器 , C OT 一 6 A 柱温箱 , JA S C

15、 O LC 一 巧o色谱工作站。D 一 苯丙氨酸、 顺式 一 异丙基环己基 甲酸、 反式一 异丙基环己基 甲酸、 N 一 ( 顺式 一 4 一 异丙基环 己基 一 拨基 ) 一 D 一 苯丙氨酸、 N 一 ( 反式 一 4 一 异丙基环己基 一 拨基 ) 一 L 一 苯丙氨酸 ( 那格列奈对映体 ) 、那格列奈及上述物质对照品 ( 含量为 9 . 8 % , H P L C法检测纯度后 , 容量法确定含量 ) 均 由石 家庄制药集团提供 ; 乙睛 、 甲醇为色谱纯 , 其他试剂为分析纯。2 试验方法与结果2 . 1对映体分离2 . 1. 1色谱条件 S U M I C H IAR L 一 O

16、A 一 3 3 )(X 手性柱 ( 2 5 0 m x 4 . 6 un , 5 卿) , 柱温 3 0 , 0 . 0 2 5 m 0 1 L 一 醋酸按的 甲醇溶液为流动相 , 1Z 0 mn 为检测波长。2. 1 . 2 线性关系及检测灵敏度 将那格列奈及其 L 一 异构体用 0 . 20 5 m o l L 一 的醋酸按的甲醇溶液分别溶解制成 0 . 加2 一 0 . 2和 0 . 0 2 一 .0 2 m g m L 一 浓度系列 , 分别进样 , 以浓度为自变量 , 峰面积科 , 42( )2 C为 因变量 , 进行线性回归 , 那格列奈及其 L 一 异构体直线方程分别为:Y =1

17、.15 x 10 7 X 一 1.3 1 x 1 0 3r = 0 .9 9 8Y =1.0 5x1 7X一205.6r =0.9 9 980按 S / N 3 测得那格列奈及其 L 一 异构体的最小检出限分别为 0 . 0 8 n g 和 0 . 12 n g 。2 . 1 . 3 样品测定及方法精密度 取本品 , 用流动相制成 1 m g m L 一 作供试品溶液 ; 取该溶液 , 用流动相稀释成 01 林g m L 一 作对照溶液 ; 分别称取那格列奈 及其对映体 , 用流动 相制成各含 0 . 10 m g m L 一 的混合液。 在上述色谱条件下 , 取对照溶液 10林L 进样 ,

18、调节灵敏度 , 使主峰高约为满量程的 巧%一 20 % , 另取混合溶液 01 卜L 进样 , 2 主峰分离度符合要求后 ( 图 2 ) , 取供试品溶液 01 林L 进样 , 按归一法计算对 映 体 含 量 , 3 批 样 品 分 别含 0 . 30 % , 0 . 0 5 % , 0 . 0 3 % 。 同批样品重复测定 6 次 , 测定结果的 RS D 为 0 . 2 2 % , 0 . 61 % , 0 . 42 % 。1 0七 一 i n/图 2 那格列奈对映体色谱图Fi g 2Ch和m a t嗯” 口 fotna e 沙n edie t io m e 比1. D 一 那格列奈( D

19、 一n a t e 沙in ds )2 . L 一 那格列奈 ( L 一n a t eglin ide )2 .2有关物质及含量测定2 . 2 . 1色谱条件 UL N A O D S 色谱柱 ( 25 0 x4 . 6 ,5林m ) , 流动相 : 乙睛 一 甲醇 一 0 . 1 mo l L 一 的磷酸二氢按 ( 5 : 2 : 4 , 用 58 % 的磷酸溶液调 p H至 3 . 0 ) , 检测波长 Z1 0 mn , 柱效按那格列奈峰计算不得低于 2 (0 刃 。2 . 2 . 2 分离专属性 取那格列奈及 4 一 异丙基环己基甲酸的顺反异构体、 D 一 苯丙氨酸 , 用流动相制成混

20、合溶液 , 进样 01 卜L , 考察色谱条件对 已知有关物质的分离性 能 , 结果表 明各相邻峰 可较好分离( 图 3 ) ; 取本品 3 份 , 分别加人 0 . 1 mo l L 一 氢氧化钠溶液、 0 . 1 om l L 一 盐酸溶液中放置 3 h 及制成水溶液于 10 加热 l h , 中和后进样 , 考察色谱条件对未知降解物的分离性能 , 结果表明主峰与上述 3 种条件下产生的降解物均可良好分离 ( 图 4 ) 。药物分析杂志101 5t/一。1图 3 那格列奈及其有关物质色谱图iF g 3C肠m 川。 朋1 fon atgelin idsna d 二 h . 司 s u b s

21、 ant c es1 . D 一 苯丙氨酸 ( D 一 p h e n y l la na i n e )2 . 顺 一 异丙基环 己基甲酸 ( 山 一 isoP or p y l e y c hlo exycl bxa ic ac i d).3 反一异丙基 环己基 甲酸 ( m 玛一i so p or p y lcy】hy l的1 ac i d)eoe xe04 . 那格列奈 ( n at e 幼in de )5 . 顺式那格列奈 ( 山 一 n ate 沙in d e ), 24( 2)a2 . 2 . 3 线性关系及检测灵敏度 取那格列奈及其顺式异构体、 顺式 一 4 一 异丙基环 己基

22、甲酸及其反式异构体、 D 一 苯丙氨酸分别用流动相制成一系列浓度的溶液 , 在上述色谱条件下分别进样 , 以浓度为自变量 , 峰面积为因变量 , 进行线性回归 , 上述 5 种成分直线方程依次为:Y = 1.24 x10 5 X 一 5 8 9 .4r =0 .9 9 6Y = 1 .19 x10 5 X 一 8 9 3 .6r=0 .9 9 3Y =8 3 3x104X一2 6 3.sr=09 9 5.Y = 1.4 1 x10 4 X 一 5 2 9 .gr=0 ,卯9 6Y = 9 .02 x 10 4 X 一 46 8 .7r = 0 .9 7 9线性范围分别为:0 ,02 一 0 .

23、38 ,0 .20 一 0 .83 , 0 . 20 -0 .3 8 , 1 . 5 一 2 8 . 5 ,0 .012 一 0 . 0 2 2 8此。按 S/ N 3测得最低 检 出限 分别 为 0 .58,0 . 62,0 . 63,0 . 04,0.0 3 n g 。0一20set/一 i n ,一 ,目 J 曰 、 J , . . . 曰 . . , , 一 一- L - 一J一匕se se se se L 1 - es 二 - - - - - L - 一z0ces一且 - - - - - 月 - - - 曰L es图 4 那格列奈与降解产物的色谱图纯 4C 加ro m at o rg

24、 翻。 5 fo n at e 砂i ni d e na d d铆侧如如 p 耐u c .A.碱降解 ( d e 脚diat on 场 b , h y dol ly s is )B . 高温降解 ( d咫邓 d a 五o nb y 址 ghh eat )C. 酸降解 ( d昭冲 d a ti on 场ac id 场 doryl si)1. 那格列奈 ( ante iglin de)2 . 2 . 4 有关物质测定及方法精密度 取本品 , 用流动相制成 1 m g m L 一 作供试品溶液 ; 用流动相稀释成 10 卜g m L 一 作对照 溶液 ; 分别取那格列奈及其顺式异构体、 异丙基环己基

25、 甲酸的顺反异构体 、 D -苯丙氨酸 , 用流动相 制成每1 m L 中含那格列 奈0 . 75 mg 、 其余为 0 . 10 m g 的混合液。 在上述色谱条件下 , 取对照溶液 01 卜L 进样 , 调节灵敏度使主峰高为满量程 的 巧% 一 02 % , 另取混 合溶液 01 林L 进样 , 各相邻峰之间的分离度符合要求后 , 精密量取供试品溶液 01 林L 进样 , 记录色谱图至主峰保 留时间 3 倍 , 用外标法计算有关物质量 , 结果见表 1 ( 那格列奈为主药 , D 一 苯丙氨酸均未检出 , 两者未列人表中 ) 。T 曲 IT七表 1那格列奈有关代】触月加如口。 比 det

26、rea. ue顺一丙 环己基甲酸批号顺一列异 基那格奈(山 一硬旧 porp刃 hlo e x y lc出 七i e(正(琢.(山 一 叫妙苗d e )No)cy 记 )仪纷3 160 . 肠ed.03DN0 2032 10 . 肠O加3 280 . 12粗品( c 川de p闹u c ts )0 . 52 自身对照法侧定( esrulstyb fesioc n 匕朋 1 m e 山记 )物质测定结果% )目朋廿o n六 , 目肠 fo ua 帜叨画 d e 【% )反一基环己基甲酸未知杂质异丙因r“ 一 咖 p功 Py】e y e lo b e材 le 田七i e(叨 k佣 )配 id )玩

27、 .s l J口.N D0.380.360.以0360.560.92总杂质量及 RS】)加 口妞 n tof 比 al tdes山比画 e .即 d SR D, n 二 3 ) 0. 4 3 , 0. 820 . 54 , 1. 20 . 5 3 , 0 . 492 . 86 , 1. 12 . 2 . 5含量测定 精密称取本品 , 用流动相制成 次 , 其 B S D 分别为 1, 2 % , 0 . 89 % , 1. 1% 。0 . 1 m g m L 一 的溶液 , 在上述色谱条件下 , 精密量3讨论取 10 卜L 进样分析 ; 另取那格 列奈对照 品 , 同法测 3 . 1 文献 【

28、5 采用 S U M IC H I凡让 一 以 一 拟刃 手性定 , 按外标法以 峰面积计算含量 , 3 批样品含量为 柱 , 但需将那格列奈衍生化 , 方可将对映体分离 , 且衍9 9 . 36 %,9 . 5 % , 9 9 . 73 % 。同批样品重 复测定 6生化条件苛刻 , 本文采用 s u M CI H IR A L 一 O A 一 3 0药物分析杂志以抖 , 42 ( )2i叩。手性柱( 2 5()x 4 . 6, 5) , 柱温 03 条件下 ,质量。以醋酸按的甲醇溶液为流动相直接分离对映体 试参考文献验表明, 醋酸馁浓度由。 升至 0 .L 一 时 , 对舰5 m o l 1

29、Konod N .Cnlici lartila of A4Y16.几Jlcin M 树,197 , 5 5(usp )l:如映体分离度逐渐增加 , 浓度再升高时转而降低 , 分离146度最高可达 3 . 0以上。 故确定 0 . 皿5 m o lL 一 的醋2苟k ue ihM .P 溉iline alofA Y4 16( A 一 4 16) .JP nJ CI认 爪陀J ,197 ,酸按的甲醇溶液为流动相 ( 色谱图见图 2 )。5 5 ( us p lp ) : 15 93I】inon。,Ki ozM tas uda,S ach i koKo.D etnta io nofN一e lena3

30、 .2那格列奈有关物质的来源 , 主要为顺反异构s一一ecnn一一 enne( T nal4i osporp y lyolh云阮 y l )Dphy lalan inad体光学异构体和少量末步反应 中间体顺式 一 4 一 异lasexacath侧 11彼绝 in h upd互u一、丙基环己基 甲酸及其反式异构体它们一般具有相sti em 比rta】na叫姐勿 加 nm( 69sw ict吨Lc衍iotJ ch 。9),H Pht dv 10 etanydet cen .”rB , 17,2: 39 7似的化学结构 , 其紫外吸收特点相近 , 紫外扫描知其4Y usu k es aot, M 朋

31、目云kON i s 诫ma, H i ash is h ink aiAn.吻s i sfoen an-iot ,.J 脚 hc or 、-均具较强末端吸收 , 故选择 210n m 为检测波长 , 以of,ew nati di 公 6in p lsaam 场 H P L Can祀c哪笋nt提高检出效果。比召r19 8 912 ( 3 ) : 材55S h i nk 越 H ,iNs磁M ,S a toY ,以 以 反pxait on ofanew an Uidal犯 t .3.3所建立的含量测定方法与有关物质检测法 为”eage,一( T anrs 一一p y eoenax ce 云肠nyl

32、)一一en -同一色谱系统 , 不仅保证 了各种相关物质 的有效检intN4i so pmllhDp hy lalanineandisti somesr场 山i司 H P 比.J峋 口卯侧吻 ,19 89,12出 , 而且确保含量测定主峰纯度 , 连同 L 一对映体 的( 3 ) : 4 57,可在更高水平上控制本 品( 本文于 2 )(X 3 年 4 月 82日收到 )检测共同订人质量标准高效液相色谱法测 定核黄素四 丁酸醋的含量及有关物质张晓松 卓 芝 张伟 张锦 邹玉 明( 重庆市药品检验所 期众 , 1)5摘要目的 : 建立高效液相色谱法测定核黄素四丁酸酷的含量和有关物质。 方法 :

33、采用迪马公司 iD 1 C I: 色谱柱 ( 2 50 x 4 .6 ,5 叩) , 以 甲醇一 水( 8:020 ) 为流动相 , 流 速为 1 . o Lm 而n 一 , 用外标法测定 , 紫外检测波长为 4 4 7 nul 。结果: 在0 . 24一 1. 2 叱范围内, 色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系 , ; 二 0 . 9 9 ; 回收率为 10 . 8 % ( RS D 二 0 . 48 % , n = 5 ) , 最低检测量为 4 gn 。 结论 : 该法准确、 简便、 灵敏 , 可用于核黄素四丁酸醋的含量测定和有关物质检查。关健词 高效液相色谱法 核黄素四丁酸醋 有关物质H P L C D止iof 形饭沮朽Tbtyd ItsRl tade t e r nn a to nan ee t r aur a t e a neeZ HA N G X iao一 s o n g , Z H U O hZ i , Z H A N G W e i , Z HA N G iJ n na d Z O U Yu 一 m i n g( C彻飞哄喀 力 . “ 阳 rjo D几咯 C。