第41课时基因工程的基本工具和基本操作程序

1、第十单元 现代生物科技专题 第41课时 基因工程的基本工具和基本操作程序 高频考点突破 考点一 基因工程的概念理解和理论基础 1.基因工程的概念理解 (1)操作环境：体外关键步骤“表达载体的构 建”的环境。,(2)优点 与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。 与诱变育种相比：定向改造生物性状。 (3)操作水平：分子水平。 (4)原理:基因重组。 (5)本质:甲(供体提供目的基因) 乙(受体表达 目的基因),即基因未变、合成蛋白质未变,只是合 成场所的转移。,2.基因工程的基本原理和理论基础概括如下图 提醒 若题目强调“目的基因”的表达过程,则只 包括“转录和翻译”两个过程,不包括目的基因的

2、复制。,对位训练 1. 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和 表达其遗传特性,只有通过鉴定与检测才能知道。 下列属于目的基因检测和鉴定的是 ( ) 检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体 细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转 录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 A.B. C.D.,C,2.科学家通过基因工程的方法，能使大肠杆菌产生 人的胰岛素。以下叙述错误的是（ ） A.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入 了重组质粒 B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达 C.DNA连接酶和限制性核酸内切酶都是构建重组 质粒必需的工具酶 D.目的基因的检测与鉴定表达过程中没有发

3、生碱 基互补配对,D,考点二 基因工程的操作工具 1.限制性核酸内切酶“分子手术刀” (1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)化学本质：蛋白质。 (3)作用 (4)作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱 氧核苷酸序列,切割特定位点。 (5)切割方式,催化作用,所以可重复利用,可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割,错位切：产生两个相同的黏性末端,平切：形成平末端,提醒 切割的化学键为磷酸二酯键。 在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶, 目的是产生相同的黏性末端。 将一个基因从DNA分子上切割下来,需要2个限制 酶,同时产生4个黏性末端。 不同DNA分子用同一种限制酶切割

4、产生的黏性末 端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶产生的 黏性末端不相同。,2.DNA连接酶“分子缝合针”,拓展提升 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,3.基因进入受体细胞的载体“分子运输车” (1)类型 提醒 质粒本质是DNA,不是细胞器;特点:小 型环状。 (2)功能：将目的基因导入受体细胞。 (3)应具备条件 能在宿主细胞内稳定保存并大量复制； 有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源 基因连接； 有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定。,最常用载体:质粒,其他载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒等,提醒 一般来说,天然载体往往不能满足人类的 所有要求,因此人们根据不同的目的和

5、需要,对某 些天然的载体进行人工改造。 常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色 的表达产物基因、发光基因等。 作为载体必须具有多个限制酶切点,而且每种酶 的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别 单一切点,若载体上有一个以上的酶切点,则切割 重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起 点区,则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载,体若只有某种限制酶的一个切点,则酶切后既能把 环打开接纳外源DNA片段,又不会丢失自己的片段。 注意与细胞膜上载体的区别,两者的化学本质和 作用都不相同。 质粒能自我复制,既可在自身细胞、受体细胞也 可在体外复制。,对位训练 3.下列关于DNA连接酶作用的叙述，

6、正确的是 （ ） A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸 二酯键 B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新 形成磷酸二酯键 C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键 D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接 起来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行 连接,B,考点三 基因工程的基本操作程序 1.基因工程图解:抗虫棉的培育过程,2.基本操作程序 (1)目的基因的获取 从基因文库(基因组文库或cDNA文库)中获取,人工合成目的基因:常用的方法有化学合成法和 反转录法。 化学合成法:蛋白质 氨基酸序列 RNA 碱基序列 DNA碱基序列 用4种脱氧核 苷酸人工合成目的基因 反转录法:

7、分离出供体细胞mRNA 单链DNA 合成目的基因,PCR扩增技术与DNA复制的比较,(2)基因表达载体的构建最核心步骤 基因表达载体的组成:启动子、目的基因、终止 子以及标记基因等。,提醒 与载体相比较,增加启动子、目的基因和 终止子三个基因片段,其功能各不相同。 启动子(DNA片段)起始密码子(RNA);终止子 (DNA片段)终止密码子(RNA)。 基因表达载体的构建方法 提醒 该过程把三种工具(只有两种工具酶)全用 上了,是最核心、最关键的一步,在体外进行。,(3)将目的基因导入受体细胞,提醒 唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。 微生物做受体细胞主要是个体微小,代谢旺盛, 繁殖速度快,获

8、得目的基因产物多。 植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。 (4)目的基因的检测和表达,对位训练 4.下列有关基因工程技术的叙述,正确的是（ ） A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶 和载体 B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸 序列 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌 繁殖快 D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达,C,5.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所 需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了 在受体细胞中表达的是（ ） A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列

9、 D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白,D,解题思路探究 思维误区警示 易错分析 基因工程中易错点辨析不清 (1)基因工程中有3种工具,但工具酶只有2种。 (2)工具酶本质为蛋白质,载体本质为小型DNA分子,但不一定是环状。 (3)标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基 因,表达产物为带颜色物质等。,(4)受体细胞中常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物大肠杆菌、酵母菌等,但要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必需用真核生物酵母菌需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟红细

10、胞,原因是它无细胞核,不能合成蛋白质。,纠正训练 1.(2009浙江卷,3)下列关于基因工程的叙述,错误 的是 ( ) A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工 具酶 C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原 无生物活性 D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞 和促进目的基因的表达,解析 基因工程中目的基因和受体细胞均可来自 动、植物或微生物;常用的工具酶是限制性核酸内 切酶和DNA连接酶;人胰岛素原基因在大肠杆菌中 表达的胰岛素原无生物活性,只有经过一定的物质 激活以后,才有生物活性。载体上的抗性基因主要 是有利于筛选含重

11、组DNA的细胞,不能促进目的基 因的表达。所以D错误。,答案 D,2.(2009重庆卷,2)下表有关基因表达的选项中,不 可能的是 ( ),解析 细菌抗虫蛋白基因可通过转基因技术转入 棉花体内,在棉花的叶肉细胞中表达产生细菌抗虫 蛋白,使棉花具有抗虫能力;人酪氨酸酶基因可在 正常人的皮肤细胞中表达产生酪氨酸酶,酪氨酸酶 催化酪氨酸转化为黑色素;动物胰岛素基因可通过 转基因技术转移到大肠杆菌体内,在大肠杆菌工程 菌细胞中合成动物胰岛素;兔属于哺乳动物,其成 熟的红细胞中没有细胞核,所以不可能表达出血红 蛋白。 答案 D,3.(2009安徽卷,4)2008年诺贝尔化学奖授予了 “发现和发展了水母绿

12、色荧光蛋白”的三位科学 家。如果将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因 连接起来组成一个融合基因,再将该融合基因转入 真核生物细胞内,表达出的蛋白质就会带有绿色荧 光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是( ) A.追踪目的基因在细胞内的复制过程 B.追踪目的基因插入到染色体上的位置 C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 D.追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构,解析 将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连 接起来组成一个融合基因,将该融合基因转入真核 生物细胞内,表达出的蛋白质带有绿色荧光,从而 可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分 布。故C正确。 答案 C,知识综合应用 重点提示 通过“抗

13、虫作物培育过程的有关基因工程知识”的考查,提升“综合运用所学知识解决自然界和社会生活中有关生物学问题”的能力。 典例分析 (2009江苏卷,34)苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀 虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植 物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因), 据图回答下列问题。,(1)将图中的DNA用Hind、BamH完全酶切后, 反应管中有 种DNA片段。 (2)图中表示Hind与BamH酶切、DNA连接酶 连接的过程,此过程可获得 种重组质粒; 如果换用Bst与BamH酶切,目的基因与质粒连 接后可获得 种重组质粒。 (3)目的基因插入质粒后,不能影响质粒的 。 (4)图中

14、的Ti质粒调控合成的vir蛋白,可以协助 带有目的基因的T-DNA导入植物细胞,并防止植物 细胞中 对T-DNA的降解。,(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠 上皮细胞表面的特异受体,使细胞膜穿孔,肠细胞 裂解,昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对 较小,原因是人类肠上皮细胞 。 (6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混 合播种,其目的是降低害虫种群中的 基 因频率的增长速率。,解析 本题重点考查转基因技术的相关知识,需特 别注意基因工程的步骤、DNA的复制、基因工程的 操作工具等知识。本题需特别注意图示过程,从中 获取有效信息,然后结合课本知识即可正确解答。 答案 (1)4

15、 (2)2 1 (3)复制 (4)DNA水解酶 (5)表面无相应的特异性受体 (6)抗性,定时检测 组题说明 特别推荐 综合应用题1、3；知识拓展提升 题2、6、8。,1.(2009福建理综,32)转基因抗病香蕉的培育过程 如图所示。质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa 等四种限制酶切割位点。请回答: (1)构建含抗病基因的表达载体A时,应选用限制酶 ,对 进行切割。 (2)培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞 的生长,欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香 蕉细胞,应使基因表达载体A中含有 , 作为标记基因。,(3)香蕉组织细胞具有 ,因此, 可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组

16、 织细胞培育成植株。图中、依次表示组织培 养过程中香蕉组织细胞的 。 解析 本题考查基因工程的有关知识。(1)从图可 看出,只有Pst、EcoR两种酶能保持抗病基因结 构的完整性,所以构建含抗病基因的表达载体A时, 应选用限制酶Pst、EcoR两种酶,对抗病基因的 DNA和质粒进行切割。 (2)卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长,欲 利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞,应,使基因表达载体A中含有抗卡那霉素基因,以此作 为标记基因。 (3)香蕉组织细胞具有全能性,因此,可以利用组织 培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成 植株。图中、依次表示组织培养过程中香蕉 组织细胞的脱分化和再分

17、化。 答案 (1)Pst、EcoR 含抗病基因的DNA、 质粒 (2)抗卡那霉素基因 (3)全能性 脱分化、再分化,2.(2008江苏卷,32)将动物致病菌的抗原基因导入 马铃薯制成植物疫苗,饲喂转基因马铃薯可使动物 获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的 图和表。,表1 引物对序列表,请根据以上图表回答下列问题: (1)在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中,使 用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶, 其最主要的特点是 。 (2)PCR过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱 基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对 引物序列,图2为引物对与模板结合示意图。请判 断哪一对

18、引物可采用较高的退火温度？ 。,(3)图1步骤所用的DNA连接酶对所连接的DNA两 端的碱基序列是否有专一性要求？ 。 (4)为将外源基因转入马铃薯，图1步骤转基因 所用的细菌B通常为 。 (5)对符合设计要求的重组质粒T进行酶切。假设 所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中 标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶 切结果作出判断。 采用EcoR I和Pst I酶切,得到 种DNA片断。 采用EcoR I和Sma I酶切,得到 种DNA片断。,解析 (1)PCR技术中需通过高温使DNA解旋,故所 用DNA聚合酶的耐热性必须要好。(2)退火温度与 时间,取决于引物的长度、碱基组成及其

19、浓度,还 有靶基因序列的长度。含有(G+C)多的引物,可采 用相对较高的退火温度。(3)DNA聚合酶与限制酶 不同,从将DNA由5端点开始复制到3端的酶,不具 有特异性。(4)农杆菌的细胞中有一段T-DNA,农杆 菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入 到植物基因中,因此,农杆菌是一种天然的植物遗 传转化体系,常用作植物转基因工程中的载体。,(5)对于重组质粒,EcoRI能切开M和X连接处,PstI能 在M和N之间专一切点处切开,将DNA分为两个片段; EcoRI仍能切开M处,SmaI则不能识别N和Y重新结合 形成的连接点,只能得到1个DNA片段。 答案 (1)耐高温 (2)引物对B

20、 (3)否 (4)农杆菌 (5)2 1,3.基因工程中,需使用的限制酶切割目的基因和质粒, 便于重组和筛选。已知限制酶的识别序列和切 点是GGATCC,限制酶的识别序列和切点 是GATC。,(1)根据已知条件和图回答： 上述质粒用限制酶 切割,目的基因 用限制酶 切割。 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,还要 加入适量的 。 请指出质粒上至少要有一个标记基因的理由： 。 (2)不同生物的基因可以拼接的结构基础是 。 (3)大肠杆菌是首先成功表达外源基因的宿主菌, 但不能表达结构复杂的蛋白质,哺乳类细胞、昆虫,细胞表达系统虽然能表达结构复杂的哺乳类细胞 蛋白,但操作复杂,表达水平低,不易推广

21、使用。基 因工程中常选用酵母菌作为受体细胞,请从细胞结 构等方面分析用酵母菌作受体细胞能克服上述不 足的理由： 。 答案 (1) DNA连接酶 检测重组质 粒(或目的基因)是否导入受体细胞 (2)DNA结构 基本相同(其他合理答案均可) (3)单细胞真核 生物,含有加工、修饰蛋白质的内质网和高尔基体; 繁殖速度快,能很快得到大量的目的基因;培养 成本低;容易培养,4.在培育转基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因 (kanr)常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因 的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获 得抗虫棉的技术流程。,请据图回答： (1)A过程需要的酶有 。 (2)B过程及其结果体现了

22、质粒作为载体必须具备 的两个条件是 。 (3)C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和 激素外,还必须加入 。 (4)如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检 测,D过程应该用 作为探针。 (5)科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的 传递符合孟德尔遗传规律。,将转基因植株与 杂交, 其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量 比为11。 若该转基因植株自交,则其后代中抗卡那霉素型 与卡那霉素敏感型的数量比为 。 若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上 作离体培养,则获得的再生植株群体中抗卡那霉素 型植株占 %。 解析 重组质粒的获得需要限制酶和DNA连接酶; 作为载体必须具备以下几个条

23、件：一是能够在宿 主细胞中复制并稳定保存;二是具有多个限制酶切,点,以便与外源基因连接;三是具有某些标记基因, 便于进行筛选等。B过程体现出了其中的一、三两 条。转基因植株与非转基因植株杂交后,后代表现 型比例为11,说明转基因植株为杂合子,该杂交 过程相当于测交;如果自交,则后代比例应为31; 卡那霉素对花粉进行了选择,保留下了抗卡那霉素 的植株。 答案 (1)限制酶和DNA连接酶 (2)具有标记基因; 能在宿主细胞中复制并稳定保存 (3)卡那霉素 (4)放射性同位素(或荧光分子)标记的抗虫基因 (5)非转基因植株 31 100,5.如图为利用生物技术获得生物新品种的过程,据图 回答： (1

24、)在基因工程中,AB为 技术,利用 的原理是 ,其中为 过程。 (2)加热至94的目的是使DNA中的 键 断裂,这一过程在细胞内是通过 的 作用来完成的。,(3)当温度降低时,引物与模板末端结合,在DNA聚 合酶的作用下,引物沿模板链延伸,最终合成两条 DNA分子,此过程中的原料是 , 遵循的原则是 。 (4)目的基因导入绵羊受体细胞常用 技术。 (5)BD为抗虫棉的培育过程,其中过程常用的 方法是 , 要确定目的基因(抗虫基因)导入受体细胞后是否 能稳定遗传并表达,需进行检测和鉴定工作,请写 出在个体生物学水平上的鉴定过程： 。,解析 (1)AB为体外DNA复制即PCR技术,与体内 DNA复

25、制原理相同,解旋方式不同,PCR技术是用高 温变性使其解旋。 (2)94时DNA双链解旋,破坏的是两条链之间的氢 键,而在细胞内DNA复制解旋时解旋酶起相同作用。(3)PCR技术与DNA复制过程原理是相同的,即碱基 互补配对,原料均为4种脱氧核苷酸。 (4)转基因动物培育中目的基因的导入常用显微注 射技术。 (5)将目的基因导入植物细胞常用的方法为农杆菌,转化法,其优点是能将外源基因导入到受体细胞的 染色体DNA分子上;在个体水平上鉴定,即通过生物 体所体现的性状来判断,抗虫棉应具有的性状为害 虫吞食后使其死亡。 答案 (1)PCR DNA复制 DNA解旋 (2)氢 解旋酶 (3)4种脱氧核苷

26、酸 碱基互补配对原则 (4)显微注射 (5)农杆菌转化法 让害虫吞食转基因棉花的叶子, 观察害虫的存活情况,以确定性状,6.下图a表示基因工程中经常选用的载体pBR322 质粒,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环 素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中,将 使该基因失活,而不再具有相应的抗性。为了检查 载体是否导入原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌,将 大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上。得到 如图b的结果(黑点表示菌落)。再次灭菌的绒布按 到图b的培养基上,使绒布面沾上菌落,然后将绒布 平移按到含四环素的培养基上培养,得到如图c的 结果(空圈表示与b对照无菌落的位置)。据此分析 并回答：,(1)pBR322质粒的基本组成单位是 。 该基因工程中,质粒上的Ampr、Tetr称为 基因。 (2)与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型是 ,由此说明目的基因插入 了 中。 (3)质粒作为基因表达载体除了具有Ampr或Tetr及 目的基因外,还必须具有 。,(4)若用pBR322质粒作为载体,通过基因工程生产