液相色谱仪工作原理液相色谱概述

1、液相色谱仪工作原理 液相色谱概述01 2009-09-02 18:44:46| 分类： 分析仪器 | 标签：色谱优化 e名京人 液色迷人 液相色谱专家|字号大中小订阅岛津shimadzu 的液相色谱概述01 液色迷人 的液相色谱概述01液相色谱仪工作原理 一、液相色谱仪高压输液系统输液系统由贮液罐、过滤器、梯度洗脱装置、高压输液泵、脱气装置等组成。高压泵是高效液相色谱仪最重要的部件之一。由于高效液相色谱仪所用色谱柱直径细，固定相粒度小，流动相阻力大，因此，必须借助于高压泵使流动相以较快的速度流过色谱这。高压泵需要满足以下条件：能提供150450kg/cm2的压强；流速稳定，流量可以调节；耐腐蚀

2、。目前所用的高压泵有机械泵和气动放大泵两种。梯度淋洗装置可以将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以达到提高分离效果，缩短分离时间的目的。梯度淋洗的作用与气相色谱中的程序升温装置类似。（一）贮液罐贮液罐为不锈钢、玻璃或氟塑料制成的容器，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。贮液罐可以是一个普通的溶剂瓶，也可以是一个专门设计的储液器。储液器往往和泵通过管路构成循环系统以便除去溶剂中的气体。现多数使用溶剂瓶，一般采用耐腐蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。（二）高

3、压输液泵气相色谱由高压钢瓶直接提供动力，高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，是流动相的动力源。高压输液泵功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。液相色谱为了获得高柱效，所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压输液泵。1.对高压输液泵的要求（1）能在高压下连续工作，一般要求耐压4050MPacm2，能在824 h连续工作。（2）输出流量范围宽：分析型填充柱在0.1-10mL/min内连续调节，制备型填充柱要求在100mL以上。（3）输出流量稳定，要求无脉冲，流量精度和重复性

4、为0.5%左右。（4）耐腐蚀，能适合各种有机溶剂、水和缓冲溶液。（5）密封性好。泵体易于清洗和维修。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。2泵的类型高压输液泵主要有恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵。恒流泵又称机械泵，主要有机械注射泵与机械往复泵两类。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定，其流量与流动相粘度和色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指输出压力恒定，但其流量随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差。如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。恒压泵和恒流泵各有

5、优缺点。（1）恒压泵A：气动泵直接式，简单，但高压气体可溶解于溶剂中，当溶剂进入检测器时会放出气体影响检测。 图8-7 气动泵B：气动放大泵泵出口压力在系统中是恒定的，流速由柱的阻力决定。压力由两活塞的面积比决定。操作简便，流量范围大，但流速取决于溶剂粘度和柱渗透性。液缸大不便清洗。流量有波动。 图8-8 气动放大泵特点：高压、无脉动、成本低，用空气压缩机或气体钢瓶低压驱动，操作成本低。缺点是更换溶剂困难。（2）恒流泵恒流泵有往复泵和螺旋柱塞泵，这类泵输出流量恒定，柱压力由柱的阻力决定。A：螺旋注射泵步进马达控制活塞移动，同时控制流量。至限位开关时停泵后退活塞、吸液，然后继续。压力大（可达60

6、 MPa），无脉冲。但清洗不便，精密而价高。 图8-9 螺旋注射泵B：往复柱塞泵图8-10 往复柱塞泵往复柱塞泵由偏心轮带动活塞往复移动，恒流输出，并通过改变电机转速调节流量。体积小清洗方便，特别适用于梯度淋洗。往复柱塞泵有明显脉冲，需采取增加脉冲阻尼器、改变凸轮形状、加电子线路保护、用多头泵系统(并联串联)等措施。往复柱塞泵目前应用较多。往复柱塞泵特点是单位时间输出的液体流量由单位时间柱塞往复的次数决定，因此，流量恒定，与系统阻力无关，可以连续不断的输送液体，更换溶剂方便，可用于梯度洗脱，主要缺点是有脉动。C：多头柱塞泵并联双柱泵少用一组单向阀。用两相差180度的凸轮推动两交替工作的柱塞。流

7、量稳定。 图8-11 多头柱塞泵D：往复隔膜泵柱室间用不锈钢薄膜隔开而使活塞不与流动相接触，靠油压迫钢膜而输出。流量稳定，单形成高压慢。 图8-12 往复隔膜泵（三） 输液体统的辅助装置1过滤器：除掉机械杂质及固体颗粒。由于液相色谱柱、进样器等都很精密，微小的机械杂质将导致这些部件的损害，而不能正常工作，同时机械杂质在柱头的积累还影响柱子的使用，因此，溶剂需要过滤。图8-13 过滤器的结构2混合器：体积不宜大。3脉动阻尼器：种类多，都有一定容积和弹性。4压力测量装置：电子压力控制器流量5流量测量装置：电子流量计6脱气装置：除掉溶于流动相中的各类气体，以保证柱效能。可采用通氮脱气、超声波脱气、自

8、动脱气机脱气等。（四）梯度洗脱装置在液相色谱中，当样品组成复杂时，有时会出现先出的峰分不开，后面的峰保留值又太大的现象，这时，可以采用梯度洗脱来调整混合溶剂的组成，改变溶剂强度或选择性。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类：1外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。2内梯度装置（又称高压梯度），先将两种溶剂分别用泵增压后，再由泵按程序压入混合室，混合，再注入色谱柱。 图8-14 梯度洗

9、脱装置示意图梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过流动相的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。流动相A、洗脱时，若样品中各成分容量因子k相差大，则大的峰宽而低且分析时间长。流动相B、是溶解力强。洗脱时，各成分很快出来，则k(12)小的峰达不到分离。AB 若将A、B流动相的组成随时间改变，则即分离好，又缩短分析时间。当我们需要混合三种流动相时，可利用电磁阀的功能将吸液分划成ABC三部分，划分比一定

10、，组分送液时是一定时，相当于GC中恒温分析。在梯度送液时，划分比则按所设定的程度时时刻刻都在变化，相当于GC中程序升温。二、液相色谱仪进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约540 cm），因此柱外效应较突出。柱外效应是指色谱柱外因素引起的峰展宽，包括进样系统，连接管，检测器中存在的死体积。柱外展宽可分为柱前和柱后展宽，进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。在液相色谱中，进样方式有隔膜式注射进样器进样，高压进样阀进样，自动进样装置等。（一）隔膜式注射进样器隔膜式注射进样

11、器有硅橡胶隔膜，在原理上与气相色谱法完全一致。用微量注射器进样的优点可柱头进样，减小死体积，充分发挥柱的效能，简单便宜。缺点是高压进样时漏液会产生误差，隔垫使用次数有限，进样量小，重复性差。（二）进样阀方式六通阀进样目前，广泛采用多通路进样阀，它可以承受很高的压力，由于进样量是由进样定量管决定的，因此，可以获得好的重复性，更换不同体积的进样定量管，可调整进样量。进样时，样品中不应混入机械杂质，溶解样品的溶剂最好与使用的流动相相同，以防止溶剂变化出现不溶物而堵塞柱子。一般高效液相色谱流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，六通阀结构如图所示，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手

12、柄置于采样位置（LOAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，由高压泵输送的流动相将样品送人色谱柱中。样品定量管的容积是固定的，因此进样重复性好。缺点是不能注入小体积样品（1.2L）,改变注入量时要更换定量管。 图8-15旋转式六通阀进样装置三、液相色谱仪分离系统(一) 色谱柱分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。进行色谱分离的首要工作是选择性能良好的色谱柱，即选择在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。色谱柱的选择应考虑：固定相类型的选择,

13、主要取决于样品分离模式； 柱填料的结构, 主要指颗粒的形状大小、均匀性、比表面、平均孔径和孔容等； 柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度；色谱柱的牌号/厂商。色谱柱多为直形，内部充满微粒固定相。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱可分为分析柱；制备柱；分析柱的保护柱。1柱材料及规格色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多,它是由内部抛光的不锈钢管制成。一般色谱柱长540cm，内径为16 mm，柱效达500010000块/m理论塔板数。凝胶色谱柱内径312mm。，制备往内径较大，可达

14、25mm 以上。2柱的填料固定液涂在担体上而成。担体有两类：一类是表面多孔型担体；另一类是全多孔型担体。近年来又出现了全多孔型微粒担体,这种担体粒度为510m，是由10 nm级的硅胶微粒堆积而成，又叫堆积硅珠。由于颗粒小，所以柱效高，是目前最广泛使用的一种担体。3保护柱一般在分离柱前有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱一样，安装在分析柱前。其作用是收集、阻断来自进样器的机械和化学杂质，以保护和延长分析柱的使用寿命。一只1cm长的保护柱就能提供充分的保护作用。若选用较长的保护柱，虽可降低污染物进入色谱柱，但会引起谱带扩张。因此选择保护柱的原则是在满足分离要求的前提下，尽可能选择对分离样品保留低的

15、短保护柱。保护柱也可装填和分析柱不同的填料，如较粗颗粒的硅胶（1015m）。保护柱装填的填料较少，价格较低，为消耗品，通常分析50100次样品，柱压力呈增大趋向时就是需要更换保护柱的信号。目前市场上供应的结构新颖的可更换芯式设计保护柱，是由保护套和可更换式保护芯，两部分组成。(二) 柱连接方式柱出、入口的连接管的死体积越小越好,一般常用窄孔(内径0.13mm)的厚壁(1.52.0mm)不锈钢管,以减少柱外死体积. (三) 柱温控制在高效液相色谱分析中，柱温一般为室温或接近室温。适当提高柱温可改善传质，提高柱效，缩短分析时间。因此，在分析时可以采用带有恒温加热系统的金属夹套来保持色谱柱的温度。温

16、度可以在室温到60之间调节。对凝胶渗透色谱仪，其柱温可从室温至150实现精确控制。四、液相色谱仪检测系统检测器实际上是一种换能装置，它将流动相中组分含量的变化，转变成可测量的电信号(通常是电压)，然后输入记录器。从原理分析，任何一种分析鉴定方法都可能用作色谱检测器。理想的检测器应该是灵敏度高、线性范围大、对所有待测组分相同响应。高效液相色谱的检测器很多，光学(紫外,荧光,折光检测器)；电化学(极谱、电导、库仑、离子选择电极)等。对检测器要求是高灵敏度；低噪声；大的线性范围；对所有化合物都响应。与GC一样。用得最多的是UV检测器，常用于有双键的芳香族化合物检测，有UV吸收就可用UV检测器。因为U

17、V对甲醇，水无吸收，所以甲醇，水可用作流动相。检测器噪声一般由于电引起。(一) 检测器分类1按性质或应用范围分类有总体性能检测器和溶质性能检测器。总体性能检测器，是响应值取决于流出物(含样品与流动相)某些物理性质的总的变化的检测器。属于这类检测器的有示差折光、电导等检测器,GC中的热导检测器也属于这类检测器。溶质性能检测器是响应值取决于流动相中溶质的物理或化学特性的检测器。属于这类检测器较多，有紫外检测器、荧光检测器、化学发光检测器、安培检测器、手性检测器等。因为溶质性能检测器仅对被测定物质有较大响应，而流动相没有响应或响应很小，所以检测灵敏度高，受操作条件变化和外界环境影响小，并且可用于梯度

18、洗脱操作。但与总体性能检测器相比，应用范围受到限制。总体性能检测器和溶质性能检测器的划分也不是绝对的，例如紫外-可见检测器常用作溶质性能检测器，但在间接光度离子色谱法中则成为总体性能检测器。2按测量信号性质分类有浓度型检测器和质量型检测器。浓度型检测器的响应值正比于溶质在流动相中的浓度，测量的是流动相中溶质浓度的瞬间变化，大部分液相色谱检测器属这一类检测器。当样品量一定时，检测器瞬间响应，峰高响应值与流动相流速无关；峰面积响应值与流动相流速成反比，峰面积与流速乘积为常数。质量型检测器的响应值正比于单位时间内通过检测器的物质的质量，峰面积与流动相流速无关，峰高响应值与流速成正比。例如库仑检测器就

19、是质量型检测器。3按测量原理分类有热学性质检测器、光学性质检测器、电学及电化学性质检测器等。光学性质检测器是根据被测物质对光的吸收、发射和散射等性质进行检测的。有较多的液相色谱检测器属这一类检测器，例如紫外-可见检测器、示差折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器、化学发光检测器、手性检测器等。电学及电化学性质检测器是根据被测物质的电化学性质进行检测的，常用的有安培检测器、电导检测器、库仑检测器、介电常数检测器、极谱检测器等。该类检测器通常驻将色谱流出液作为化学电池的一个组成部分，通过测量电池的某种参数(如电流、电阻、电量等)进行检出和测定。性质进行检测的。利用热学原理进行检测的热学性质检测器

20、有光声、热透镜和光热偏转检测器等，分别利用了光声光谱和光热光谱等技术。激光检测器的应用使灵敏度得到较大的提高，这类检测器的应用仍有待于发展。4其它分类按信号记录方式不同可分为积分型和微分型检测器；按样品是否变化可分为破坏性和非破坏性检测器。以上各种检测器中最常用的液相色谱检测器依次是紫外检测器、示差折射检测器、荧光检测器和电化学检测器等。近年来出现的光散射检测器是新兴的通用型检测器。近年来发展迅速的光电二极管阵列检测器虽然价格较高，仍不失为一种较理想的检测器。(二) 常用检测器的主要性能检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量

21、的变化不敏感等。评价检测器主要考虑以下几点:噪声；基线漂移；灵敏度；线性范围；检测池的体积。检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。检测器的线性范围：大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性响应。灵敏度在色谱分析中有三种不同的表示法，有检测器本身的灵敏度、整个色谱体系的浓度灵敏度和质量灵敏度。对于定量分析来说，最重要的是色谱体系的灵敏度，它还包括色谱柱以及仪器的其它部分的影响。检测器的灵敏度(CD),实际上指检测限，即通常指相当于两倍噪音信号的溶质浓度。而色谱体系的最小检测限应是柱外效应10%的最大进样体积所对应的二倍于噪音峰高所对应

22、的样品浓度。对于毛细管气相色谱和高效液相色谱，检测器的色谱峰展宽是柱外效应的一个主要来源。一般仪器厂商在设计时已把检测器的色谱峰展宽减少到最低程度。 八十年代初就有各种各样的液相色谱检测器问世，最流行的是可变波长检测器，固定波长检测器由于最适用于各种芳香化合物检测,也得到广泛应用。折光指数检测器，主要是应用于空间排阻色谱在高分子工业以及食品和饮料工业中糖的检测。发展最迅速的是可变波长光电检测器和电化学检测器。激光检测器的使用，包括光扫描、荧光、光电离子化、热光离子化、折光率、光度和声光检测器。在离子色谱(IC)中改进选择性和敏感度。液相色谱新的检测技术不断发展，以适应毛细管和微球柱大小的需要，

23、近几年正在迅速发展的液相色谱检测技术，有光谱和电化学检测器二大领域，也考虑到扩大柱后流动试剂检测领域。在液相色谱中生物化学柱后反应检测技术，酶、蛋白质和抗体的使用，改进检测器选择性和敏感度。当今面临控制环境污染分析和监测方面的挑战，提供分析金属离子的色谱技术，液相色谱技术同特殊元素检测相结合，可以分离金属络合物结构，对于大气、水、残渣和鱼类的金属离子分析具有重要意义。在近年来兴起的DNA分析领域中，已有不少人报道评价聚合酶链反应产品的液相色谱分离和检测中定量分析准确度和精密度。 各种各样检测器的研究论文层出不穷，如紫外可见光度检测器， 拉曼光谱检测器，荧光检测器，化学荧光检测器，质谱检测器，电

24、化学检测器，核磁共振检测器以及光电二极管阵列检测器等。近几年出现的蒸发激光散射检测器(FLSD)有希望成为高效液相色谱全新的通用灵敏的质量型检测器。总之，检测器研究的共同方向均朝着灵敏度高、重现性好、响应快、线性范围宽、适应范围广、对流动相流量和温度波动不敏感、死体积小等特性。表8-3检测器的主要性能性能/检测器紫外荧光折光安培电导测量参数吸光度荧光强度折射率电流电导率类型选择性选择性通用选择性选择性池体积11032031011噪声/测量参数单位10-410-310-710-910-3最小检测浓度/g/mL10-1010-1110-710-12103线性范围103103104105104温度影

25、响小小大大大流速影响无无有有有可否用于梯度洗脱能能不能不能不能对样品有无破性无无无无无（三） 紫外检测器（UVD）1. 工作原理与结构紫外-可见光检测器（UVD）又称紫外检测器。约有80的样品可以使用这种检测器，是HPLC中应用最广泛的检测器。它可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型。固定波长紫外检测器常采用汞灯的254nm或280nm谱线，许多有机官能团可吸收这些波长。可变波长紫外检测器实际上是紫外可见分光光度计作检测器。它既可测紫外区（190350nm)的光吸收变化，也可向可见光区(350700nm)延伸。紫外检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定

26、波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。光学系统如图8-16，由光源产生波长连续可调的紫外光或可见光，经过透镜和遮光板变成两束平行光，无样品通过时，参比池和样品池通过的光强度相等，光电管输出相同，无信号产生；有样品通过时，由于样品对光的吸收，参比池和样品池通过的光强度不相等，有信号产生。根据朗伯比尔定律，样品浓度越大，产生的信号越大，紫外检测器灵敏度高，检测下限约为10-10gmL；而且线性范围广，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱;不破坏样品，可用于制备。紫外检测器缺点是只对具有-或P-共轭结构的化合物才能检测。流动相的选择有一定限制。图8-16紫外检测器的光学系统

27、2. 特点UVD广泛应用源于以下的特点:（1）灵敏度高；噪声低，可降至10-4。最小检测浓度达10-10 g/mL。最小检测量达10-12 g数量级。线性范围宽，应用广泛。（2）对流动相基本无响应，属溶质性能检测器。受操作条件变化和外界影响很小，一般对流速和温度不太敏感，适用于梯度洗脱。（3）属选择性检测器，对无紫外吸收的物质如饱和烃及有关衍生物无响应。（4）需选用无紫外吸收持性的溶剂作流动相。（5）属浓度敏感型检测器。（6）属非破坏性检测器，可要用于制备色谱，也能与其它检测器串联使用。（7）结构简单，维修方便。3. 光电二极管阵列吸光度检测器(photodiode array detecto

28、r； PDAD)1982年惠普公司推出世界上首台光电二极管阵列检测器以来，HPLC获得许多重大发展，一次进样可得到更多信息，数据处理更快。光电二极管阵列检测器有1024个二极管阵列，是同时可以得到吸光度、波长、时间这样三维光谱-色谱图情报的检测器。能以实际的时间瞬时测定在所有波长上的吸光度，可得到立体的光谱-色谱图(见图8-17)。为分析工作者提供了十分丰富的定性定量信息。二极管阵列检测器的特殊功能在许多领域中发挥了重要作用。(1)在药物学和毒物学中的应用生物体内的毒品药物代谢产物的研究鉴定是个难题，尤其是浓度低及复杂生物基体组成变化时，识别更困难。药物代谢光谱往往与原药物相似。用二极管阵列检

29、测器，可以将每个色谱峰的光谱图与原药物光谱图进行比较来确认原药代谢物色谱峰。(2) 在生物科学中的应用肽和蛋白质的制备过程中，必须控制最终产品的纯度。高效液相色谱法可分离出肽和蛋白质中的杂质。由于肽和蛋白质的光谱差异性很小，用普通紫外检测器不能检测出肽和蛋白质中的杂质，只有利用极管阵列检测器提供的高重现性光谱才能准确测定。(3) 在环境科学中的应用饮用水中农药污物的标准分析方法是GC-MS联用法。但对不稳定化合物，HPLC是一种理想方法。利用二极管阵列检测器结合自动谱图检索，成功分析了饮用水中的苯脲类除草剂、三嗪类农药及甲氨酸脂。有文献报导在河水检测中，利用固相萃取-液相色谱-二极管阵列检测器

30、建立自动报警系统：该系统利用聚合物固相萃取装置和二极管阵列检测器，在5060min内可分析100mL河水中100150种有机微量污物。(文献：Wilson I.D.andBrinkman U.A.Th,J.Chrmatogr.A,203,1000:325356)图8-17 立体的光谱-色谱图（四） 示差折光检测器（differential refractive index detector）示差折光检测器是除紫外检测器之外应用最多的检测器。1. 工作原理示差折光检测器是通过连续测定色谱柱流出液折光率的变化来检测样品浓度的。就是检测参比池（流动相本身）和样品池中流动相之间的折光率差值。差值与浓度

31、呈正比。见图8-15和图8-16，当参比池与测量池充满流动相时，它们的折光率相等，此时，光强相抵消，当测量池有组分时，因折光率与流动相不同，则折光发生一个距离的偏转，偏转程度与组分的性质、浓度有关。图8-15示差折光检测器原理图8-16示差折光检测器图8-17偏转式差示折光检测器光路图2特点示差折光检测器的优点是通用性强，操作简便；缺点是灵敏度低，对温度变化敏感。此外，由于洗脱液组成的变化会使折射率变化很大，因此，这种检测器也不适用于梯度洗脱。（1）示差折光检测器属于总体性能检测器，是根据不同物质具有不同折射率来进行组分检测的。凡是具有与流动相折射率不同的组分，均可以使用这种检测器。如果流动相

32、选择适当，可以检测所有的样品组分，因此是一种通用型检测器。它对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能检测。示差折光检测器还适用于流动相紫外吸收本底大，不适合用紫外检测器的体系。在凝胶色谱中示差折光检测器是必不可少的，尤其是对聚合物，如聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布的测定。（2）属浓度敏感型检测器。其响应信号与溶质浓度成正比。（3）示差折光检测器属于中等灵敏度检测器，灵敏度不高是差折光检测器的最大缺点。最小检测浓度达10-6 10-7g/mL，不能做痕量分析。线性范围宽小于105。（4）示差折光检测器对压力和温度变化敏感。折光物质由于压力和温度变化引起该物质密度变化，

33、而导至折射率的改变。（5）示差折光检测器最常用的溶剂是水，原则上所有透明溶剂都可以使用。流动相强度与的折射率无关。选择适合的溶剂，检测器的响应可以加强。示差折光检测器最大的优点是其通用性，但这同时也是它的缺点。由于溶剂之间的折射率只相差零点几个折光单位，因此溶剂组成的任何变化对测定都有有明显影响，如二元、三元溶剂混合不完全；色谱柱漏液；溶剂中有气泡等。一般空气饱和溶剂的折射率较稳定，故常采用空气饱和溶剂作流动相。另外，为避免流通池中气泡的形成，还要将检测器的流动相出口位置提高。（6）示差折光检测器不能用于梯度洗脱。3结构示差折光检测器有反射型和折射型，见图8-15。反射式示差折光检测器是根据下

34、述原理制成的：光在两种不同物质界面的反射百分率与入射角和两种物质的折射率成正比。如果入射角固定，光线反射百分率仅与这两种物质的折射率成正比。光通过仅有流动相的参比池时，由于流动相组成不变，故其折射率是固定的；光通过工作池时，由于存在待测组分而使折射率改变，从而引起光强度的变化，测量光强度的变化，即可测出该组分浓度的变化。偏转式示差折光检测器是根据下述原理：当一束光透过折射率不同的两种物质时，此光束会发生一定程度的偏转，其偏转程度正比于两物质折射率之差。（五）荧光检测器(fluorescence detector；FD)荧光检测器适用于本身具有荧光的物质，或将无荧光物质衍生成荧光体物质的检测。1

35、工作原理物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光波长较长的光，这种光称为荧光。在其他条件一定的情况下，荧光强度与物质的浓度成正比。许多有机化合物具有天然荧光活性，另外，有些化合物可以利用柱后反应法或柱前反应法加入荧光化试剂，使其转化为具有荧光活性的衍生物。在紫外光激发下，荧光活性物质产生荧光，由光电倍增管转变为电信号。图8-18荧光检测器光路示意图2特点（1）检测器灵敏度非常高，其检出量可达10-13g，荧光检测器灵敏度比紫外检测器高出23个数量级，适合于痕量分析。蒽是常用的衡量检测器灵敏度的基准物质。（2）有良好的选择性。荧光检

36、测器的高选择性能够避免不发荧光分子的干扰，这是其独特的优点。它适合于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、胺类、维生素、蛋白质等荧光物质的测定。（3）线性范围较宽，约104105。（4）受外界条件的影响较小。（5）只要选择作流动相的溶剂不发荧光，荧光检测器就能用于梯度洗脱。（6）其缺点是应用范围较窄。（六）其它检测器检测器主要有安培检测器、电导检测器、库仑检测器、极谱检测器等。检测器已被广泛应用于环境污染物和活体代谢物的分析、食品卫生、临床化学、和生物医学研究等。1安培检测器安培检测器要求在电解池内有电解反应发生，即在外加电压力作用下，利用被测物质在电极上发生氧化还原反应引起电流变化进行测定的一种

37、方法。原则上凡是具有电活性的化合物都可用安培检测器来检测。有如下特点：（1）安培检测器特点是灵敏度高、选择性好、线性范围宽、结构简单、检测池体积小、柱外效应较小、噪声低、响应速度快。（2）检测器所使用的流动相必须具有导电性。安培检测器采用的流动相中必须有浓度为0.01 0.1 mol/L的电介质存在。（3）安培检测器对流动相的流速、温度、PH值等比较敏。（4）测量还原电流时，流动相中痕量的氧也可能发生电解反应，引起干扰。（5）由于电极表面可能发生吸附、催化等氧化还原反应，电极都有一定寿命，目前还没有可靠的再生方法，因此需要经常清洗与理换。2电导检测器电导检测器已成为离子色谱最常用的检测器。与安

38、培检测器不同，电导检测池内没有化学反应发生，电导检测器是通过测量溶液中离子的电导变化来测定样品浓度的。电导检测器结构简单、成本低、线性范围宽、死体积小。原则上离子状态的物质都可以用电导检测器检测。电导检测器是一种通用型的电化学检测器。(七)蒸发光散射质量检测器(Evaporative Light-Scatting Mass Detector, ELSD)HPLC的发展中受到限制的一个原因, 就是缺少像GC中的FID一样的灵敏、通用型的检测器。20世纪80年代后研制的蒸发散射质量检测器给这一领域带来希望，并向具有真正通用型意义的检测器方向发展。这就是：样品结构不需要具备紫外发色团和合适的折射率；

39、对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不敏感；对各种物质的响应因子很接近；在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质。 1原理在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为I = k mb (8-28)(8-28)式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。散射质量检测和电导测定一样，电导是所有离子的通用性质，光散射是所有粒子的通用性质。对于色谱法来说，溶质已经分离，关键的问题是如何除去流动相和保证检测条件的一致性。蒸发散射质量检测器的工作原理见图8-19：经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器，被高

40、速的载气流（氦气、氮气或空气）喷成一种薄雾。这些雾粒子进入可控制温度的蒸发器（漂移管）中，使流动相气化蒸发，溶剂蒸发后剩下的不挥发组分成为微小的雾状颗粒，进入光散射池进行检测。在光散射池中溶质被光源照射而产生光散射，根据散射光强度正比于溶质粒子数目及粒子的大小，确定组分的含量。2结构（1）雾化池中雾化：经色谱分离的组分随流动相进入与色谱柱出口直接相连的雾化器针管中，在雾化器末端器流出物与高速气流（雾化载气流速：2 5 L / min）混合成均匀的气溶胶雾状颗粒。（2）漂移管中蒸发：这些气溶胶雾状颗粒进入可以控制温度（蒸发器温度：100 180）的蒸发漂移管中，使流动相汽化蒸发，只剩下挥发性较小

41、的被测物质雾状颗粒，它们高速通过蒸发漂移管进入光散射池。（3）光电检测器中检测：在光散射池中，光源光线通过光散射池中的被测物质雾状颗粒，然后被光阱捕集，以防止反射。样品颗粒散射光源发出的光用光电检测器接收，转换成电信号。蒸气状态溶剂通过光路时，光线反射到检测器上成为稳定的基线信号。雾状溶质颗粒通过光路时，被检测器收集。测量得的信号与在光散射池中样品的量成正比。图8-19蒸发光散射质量检测器的工作原理3 蒸发散射质量检测器的优缺点(l)通用性强，灵敏度高于示差折光检测器。灵敏度低于荧光、紫外检测器。(2)对流动相系统温度变化不敏感。可进行梯度洗脱。(3)响应因子具有一致性。蒸发散射质量检测器的响

42、应值仅取决于光束中溶质颗粒的大小和数量，检测器对的有物质几乎具有相同的响应因子。因此无需测定定量校正因子。(4)可消除流动相和杂质的干扰，提高了分辩率。与光吸收检测器相比，能解决最困难的HPLC检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检测。(5)便于应用于质谱分析。因为蒸发散射质量检测器与质谱条件的要求是一致的。(6) 蒸发散射质量检测器受样品组分和流动相挥发性因素限制。要求样品组分应是非挥发性或半挥发性的，而流动相应是挥发性溶剂。(7) 对某些样品，蒸发散射质量检测器线性范围窄，有时不呈现线性关系，定量分析较为复杂。(八) 化学发光检测器(CL)化学

43、发光分析具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单的优点，但选择性较差。而高效液相色谱是非常有效的分离手段，将两者联用，可克服化学发光分析选择性差的缺点。而化学发光检测器又为高效液相色谱提供了高灵敏度的检测手段。1原理化学发光检测器和荧光检测器有相似之处，两者都是发光检测法，量激发态中间体的产生方式不同，化学发光检测法由人学反应产生激发态中间体，而荧光检测法基于对光源光能的吸收。化学发光检测器不需要激发光源，而来自激发光源背景噪声影响了荧光检测法灵敏度。因此化学发光检测法灵敏度要比荧光检测法高二人数量级。可以与激光诱导荧光检测法相媲美。化学发光检测法的检测限可达10-15 10-18moL。2特点(1

44、)与荧光检测法相比，化学发光检测通常可使灵敏度提高30-100%，在酶参加的反应中该方法的选择性也大为提高。(2)与激光诱导的荧光检测法相比，化学发光检测器对衍生试剂有较宽的选择范围，激光诱导的荧光检测仪器价格昂贵。(3)化学发光强度对各种环境因素是敏感的。如温度、溶剂、离子强度、pH和其它物质的存在。化学发光反应的发射强度不是常数，而是随时间而变化。发射强度随时间衰变曲线不同的CL反应，有不同的衰变曲线。即使同一反应，在不同的条件其衰变曲线也不同。3应用(1) 过氧草酸酯化学发光反应荧光化合物测定。多环芳烃，氨基多环芳烃，蒽、芘、苯并芘、氨基蒽、氨基芘。荧光衍生分析物的测定。一些分析物本身没

45、有荧光，因此必须进行荧光衍生反应，一般衍生在柱前完成。丹磺酰氯及其衍生物。丹磺酰氯是一种非常灵敏的荧光标记试剂，它的分子体积小，已广泛采用。主要用于伯、仲胺和酚羟基化合物。如氨基酸、儿茶酚胺、甾二醇以及某些化合物。丹磺酰氯可用来衍生羰基化合物，如醛、酮、酮基皮质甾类、氧代甾族化合物和胆质酸。其它衍生物试剂，如荧光胺已用于衍生儿茶酚胺。香豆素类试剂可用于衍生含羰基的羧酸和前列腺素、胺和氟代嘧啶类化合物。检测由酶反应产生的过氧化氢。酶反应产生的过氧化氢在过量的荧光物质存在下可由化学发光检测器。此反应可在pH=7完成，接近大多数的酶反应的pH。检测能熄灭过氧草酸酯化学发光的物质。过氧草酸酯的化学发光

46、反应可被某些物质熄灭，使发光强度大大降低。基于此原理，已研究过HPLC-熄灭化学发光检测器，可用于溴化物、碘化物、硫化物、亚硫酸盐、苯胺类及某些有机硫化合物。(2) 鲁米诺(Luminol)化学发光反应金属离子可催化Luminol化学发光反应，因此，金属离子用离子交换柱分离后，可用Luminol化学发光反应测定。如：Cu2+、Co2+、Ni2+利用络合剂与催化剂反应，对Luminol化学发光反应产生抑制作用。氨基酸；药物（儿茶酚胺、氨基糖苷抗菌素、庆大霉素）；蛋白质（球蛋白、白蛋白）。用Luminol作为标记试剂。测定luminol及衍生物的浓度已用于羧酸、胺、甲基睾酮、氨基酸、核苷、地谷新、

47、人血清中脱氧麻黄碱等的测定。(3) 光泽精化学发光反应利用血液及尿液中有机还原剂（还原性糖、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、尿酸等）与光泽精的化学发光反应。通过HPLC分离后，用光泽精体系检测这些还原性物质。(4) 生物发光反应可测三磷酸腺苷、胆酸、肌醇磷酸酯异构体(5) 其它化学发光反应 钌试剂化学发光反应。钌试剂和还原剂作用可产生化学发光反应，发现脂肪胺与试剂反应产生化学发光反应的次序：叔胺仲胺伯胺，芳香胺几乎不发生反应。钌试剂作为柱后化学发光反应衍生试剂，用于脂肪叔胺的HPLC化学发光反应检测，该检测系统也曾用于抗生素氨基酸、肽和蛋白质的检测。结论： 以过氧草酸酯CL和Luminol CL体系使

48、用较多。 化学发光检测法是最灵敏的方法之一，其灵敏度比普通荧光法一般高两个数量级。 但CL和HPLC相偶合的条件需要进一步研究和优化。 为了拓宽分析物的范围，衍生化技术的深入研究仍是很重要。五、色谱数据处理系统色谱数据处理通过ADC转换器,把模拟信号转换成数字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。（一） 峰的检测峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。有各种判别峰的起点与终点的方法,各有利用弊,一般常采用下面两种方式判别峰讯号的变化。1斜率判别法(一阶导数法)。依照信号斜率的变化检测信号，如图8-20的右图，用此方法，斜率设定必须合适,不

49、可过大或过小。斜率参数设定过大，支丢失部分峰面积，甚至于峰丢失。斜率参数设定过小，会引入杂质峰面积。斜率参数设定通常可以通过空白基线白的检测自动设定。2依照积分面积检测峰信号:色谱峰面积(或峰高)正比于该组分的浓度。峰面积的准确测量取决于基线的判断。图8-20保留时间和峰面积的计算(二) 数据采集(三) 基线修正基线修正依赖于另一个参数:漂移。若事先未设定漂移值，即默认为“0”，会对基线作自动修正。(四) 重叠峰的分离：在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能完全分离的情况。通常采用谷-谷规则或预设基线漂移值参数来解决。也可自动处理或人工修正。1自动程序如果要改变条件重复分析，通常要更换各

50、种参数(如峰宽、斜率、漂移、最小峰面积、变参时间、锁定时间、衰减、样品量、内标一、校正次数)。可把不同条件设定在不同文件中，每次分析时变更文件号就可以。2人工修正(五) 色谱仪自动定性和定量分析定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时,一般通过保留值来识别峰。但由于各种因素的影响,在重复多次分析中,保留值会有一定的变化,可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。1. 定性分析峰定性可采用绝对保留时间或相对保留时间法，前一种鉴别位于预定保留时间容限内的峰，后者根据分析条件变化引起保留时间相对变化，用相对保留时间法鉴别色谱峰。绝对保留时间法中，只

51、要被测组分的标准保留时间与实测时间的差值小于保留时间容限就可被鉴别。保留时间容限可用时间窗或时间带来表示。前者是为每一个峰都设定一个时间作容限；后者是对所有峰都用相同百分数作容限。(1)“时间窗”法 (Time Window)：tRt对整个色谱图上各个峰的保留值都设定相同区间“时间窗” ，规定图中各个峰保留时间的变化范围。该法设置简单，但用于识别保留时间相差很近的相邻峰不大方便。（2）“时间带”法 (Time Band): tR(1a%)对每个需识别的定量峰，都设定一个保留时间的相对变动范围。该设置较麻烦，但对不同峰可给出不同的变动范围，对识别相邻峰的分辨率较好，同时用于编组定量分析也很方便。

52、1 定量分析及ID表所有色谱数据处理机均支持面积归一、校正面积归一、带比例因子的校正面积归一、外标法、内标法等定量计算方法。建立合适的ID表（选择合适的MODE）对准确定量很重要。选择内容是：用峰面积还是用峰高定量方法；峰的识别用“时间窗”法还是“时间带”法；校正方法用“单点”法还是“双点”法。ID表内容还包括：峰的保留时间；组分名等。图8-21色谱工作站控制仪器参数示意图(六) 色谱数据处理机和色谱工作站的差别色谱数据处理机的功能：色谱数据处理；A/D模数转换接口，A/D模数转换是将检测器输出的电压信号转换成数字信号，然后通过软件对数字信号进行处理。色谱工作站的功能见图8-21：色谱工作站除

53、了色谱数据处理机功能外，还有色谱仪控制卡，可控制仪器参数。目前国外的仪器厂家均有各自专用的色谱工作站。如岛津批、安捷伦、PE等。色谱工作站配备的仪器控制功能可对色谱仪的一般操作条件进行控制，包括程序升温（梯度淋洗）、自动进样、流路切换、阀件控制等操作。(七) 色谱智能化和专家系统简介色谱智能化是新一代色谱仪的发展方向,其特点是代替人的部分智能,选择分析方法和确定最佳色谱条件,并有条件地进行部分组分定性工作。这项工作不仅要求计算机技术,更重要的是,要加强色谱的基础理论研究,提高色谱操作技术,特别是制备出性能稳定的色谱柱,这样才能使操作规范化,以实现人工智能色谱。色谱专家系统是色谱智能化的一个重要

54、组成部分,它从人工智能和数值计算方法出发开展研究,应包括以下几大部分：1分离模式和柱系统的选择；2预处理方法和检测器的选择；3分离条件最优化；4在线色谱峰的定性和定量；5色谱硬件的诊断。图8-23选择流动相的一般方法图8-23表达了选择流动相的一般方法。将整个三角形代表所有的溶剂，首先排除一些物理性质（沸点、粘度、紫外吸收）不适用于LC的溶剂（三角形底部用横线划的部分面积），在剩下物理性质适用的溶剂中，不需选择洗脱强度适当的溶剂，即选择能使被分析样品中组分的容量因子k在110范围内的溶剂。对含多种组分的样品，k在可扩展在0.520范围内。这样又排除了图8-23中打交叉线部分的面积。最后选择分离

55、因子大于1.05，这样只有位于顶点的空白面积才能满足要求。当选择了合适分离因子和容量因子k的溶剂后，还必须与柱效n高的色谱柱结合才能获得满意的分离度。由上述可知，表征溶剂特性的化学与物理参数对选择溶剂很重要。（三）表征溶剂特征的重要参数表征溶剂特征的参数有沸点、分子量、相对密度、介电常数、偶极矩、折射率、紫外吸收截止波长等。与HPLC分离密切相关的是溶剂强度参数，溶解度参数，极性参数和黏度。这些参数值可在有关手册中查到。1溶剂强度参数溶剂强度参数定义为溶剂分子在单位吸附剂表面积A上的吸附自由能E，表征了溶剂分子对吸附剂的亲和程度。=E/A值越大，表示溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强。2溶解度参数

56、溶解度参数表示溶剂的极性，这是从发子间作有力角度来考虑的。在正相液液色谱中，溶解度参数越大，洗脱强度也越大，会使容量因子k越小。在反相液液色谱中，溶解度参数越大，洗脱强度也越小，会使容量因子k越大。3极性参数P极性参数P又称为极性指数，P是用Rohrshneider溶解度数据推导出来的。它表示每种溶剂与乙醇（参数xe）、对二氧六环（参数xd）、硝基甲烷（参数xn）三种极性物质相互作用的量度。Xe反映了溶剂作为质子接受体的量度，xd反映了溶剂作为质子给予体的量度，xn反映了溶剂作为强偶极子之间相互作用的能力。极性参数P是判定溶剂洗脱强度的依据。常用溶剂的P和Xe、xd、xn可查表。在正相液液色谱

57、中，极性参数P越大，洗脱强度也越大，会使容量因子k越小。在反相液液色谱中，极性参数P越大，洗脱强度也越小，会使容量因子k越大。因此可通过改变洗脱剂的P值，就可改变被分离样品组分的选择性。4黏度溶剂的黏度（动力黏度）是影响色谱分离的重要参数。溶剂的黏度大时，会降低溶质在流动相中的扩系数及两相间的传质速度，并降低了柱子的渗透性，导致柱效的下降和分析时间的延长。溶剂的黏度应保持在0.40.5MPa.s以下。对黏度为0.20.3MPa.s的溶剂，可与黏度大的溶剂混合，组成溶剂强度范围宽、黏度适用的混合溶剂。对黏度小于0.2 MPa.s的溶剂，由于沸点太低。在高压泵输送时会产生气泡而不宜单独使用。第五节