多靶点pCRISPR载体(单子叶和双子叶植物用)使用方法

1、.crispr/cas9-based genome editing technologya robust crispr/cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组()1. pylcrispr/cas9多靶点载体介绍crispr/cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。crispr/cas9切割靶序列仅需要single-guide rna (sgrna)

2、以及由sgrna引导的cas9蛋白，比锌指核酸酶（zfns），talens更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。我们利用crispr/cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点crispr/cas9基因打靶载体系统。本套载体将cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgrna表达盒的多克隆位点bsa i位于靠近双元载体rb位置。sgrna表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和pcr方法拼装好，再利用golden gate或gibson assembly克隆方法组装到双元载体上。figure 1. a working model of

3、the crispr/cas9 system. the cas9-sgrna complex locates to the target site to cleave the dna to produce double strand break (dsb).精品.2crispr/cas9载体与sgrna载体图谱2.1crispr/cas9双元载体本套载体系统的双元载体骨架为pcambia-1300 (accession: af234296)，cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有5端gc含量较高的特征 (figure 2)。这些质粒在e. coli top

4、10f(laciq) 菌株繁殖，该菌株laciq基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdb大肠杆菌致死基因的表达。pylcrispr/cas9pubi-h, -b载体中的cas9p用pubi驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子叶植物，目前优先使用pylcrispr/cas9p35s-h, -n,-b。我们用pylcrispr/cas9pubi-h在拟南芥也打靶成功，但与pylcrispr/cas9p35s-h对拟南芥的打靶效率比较正在测试中。我们对pylcrispr/cas9载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表1。figure 2. a crispr/cas9 system for mo

5、nocot and dicot plants.pylcrispr/cas9pubi-h, -b (above); pylcrispr/cas9p35s-h, -n,-b (below); hpt (-h), bar (-b), and npt ii (-n) encode hygromycin b phosphotransferase, ppt acetyltransferase and neomycin phosphotransferase ii, respectively. nls, nuclear localization sequence. the key sequences incl

6、uding restriction sites for cloning and analysis of sgrna expression cassettes are given. two bsa i-cutting sties bsa i (b-l) and bsa i (b-r) for cloning the sgrna expression cassettes are separated by a shorten form of the ccdb negative selection gene.精品.表一 pylcrispr/cas9载体新旧命名对应关系新命名原命名适用植物种植物抗性py

7、lcrispr/cas9pubi-hpylcrispr/cas9-mh,pylcrispr/cas9-mtmono单子叶/双子叶潮霉素pylcrispr/cas9pubi-bpylcrispr/cas9-mb单子叶/双子叶草甘磷pylcrispr/cas9p35s-hpylcrispr/cas9-dh双子叶潮霉素pylcrispr/cas9p35s-bpylcrispr/cas9-db双子叶草甘磷pylcrispr/cas9p35s-npylcrispr/cas9-dn双子叶卡那霉素2.2 crispr/sgrna vectors sgrna序列全长96 nt，分为两部分，5决定靶序列的20碱

8、基 (seed sequence)和3区域为保守的结构序列。因此构建针对特定靶位点的sgrna，只需要克隆决定靶序列的5端20 nt (seed sequence)。 sgrna用small nuclear (sn) rna u6/u3启动子驱动，以保证转录出的sgrna停留在细胞核中与cas9结合。本方案用pcr扩增的方法构建包含靶序列的sgrna表达盒，并在扩增引物5端引入顺次排列的位置特异bsa i 酶切位点，用于golden gate克隆。或在扩增引物5端加入互补序列用于gibson assembly 连接克隆。为了提高构建好的多靶点载体的稳定性，避免在农杆菌或者植物基因组中sgrna

9、表达盒之间发生同源重组，从水稻克隆了4个不同snrna启动子(osu3,osu6a，osu6b，osu6c)，用于单子叶植物；从拟南芥中克隆了4个不同snrna启动子（atu3b，atu3d，atu6-1，atu6-29），用于双子叶植物。精品.figure 3(a) overall structure of eight basic sgrna intermediate vectors. (b) the two bsa i cutting sequences are given in twelve sgrna vectors (in a linear form), including othe

10、r four vectors (pylsgrna-osu3/lacz, pylsgrna-osu6a/lacz, pylsgrna-atu3b/lacz, and pylsgrna-atu3d/lacz) that have an additional lacz gene (198 bp) as a cloning selection marker. the u3 and u6 promoters from rice (os) and arabidopsis (at) and the sgrna sequence are separated by the vector backbone, to

11、 avoid amplification of the uncut plasmids by pcr with short extension time during the construction of sgrna expression cassettes. cutting (small arrows) with bsa i produces different non-palindromic sticky ends to the promoters and an end to the sgrna sequence. (c) a representative regular target a

12、nd an irregular target, their target adaptors for the osu6a promoter, and the transcribed 5 sequences are shown. a ligated target-sgrna expression cassette is amplified by nested pcr using primers u-f/gr-r and pps/pgs. pps and pgs are position-specific primers with bsa i sites for the golden gate li

13、gation (table s1), or with overlapping ends for gibson assembly (table s3). 3.靶位点选择和接头设计3.1 靶位点选择建议对1个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因)，以降低某靶点打靶不成功的风险。可在orf 5区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。设计靶点的原则：(1) 目的基因的正链和负链靶点的打靶效率大致相同，都可以设计靶点；(2) regular targets & irregular targets (见以下说明)有同等打靶效率；(3) 靶点的

14、gc%尽量不要低于40%，靶点序列gc%偏高(50-75%)有较高的打靶效率。靶点内(按5-n20ngg-3方向)不要有连续4个以上的t，以防rna pol iii将其作为转录终止信号；(4) 虽然非特异打靶（脱靶）对植物基因打靶不是很重要的问题，但应进行靶点特异性分析：用靶点+ngg（前后各加几十碱基）与基因组做blast (选somewhat similar sequences），避免使用与同源序列差异少于5个碱基的靶点(在切点附近和pam可有2个碱基差异就具有特异性)。可以使用在线软件crispr-p (/crispr/)做这个分析，但可使用的靶

15、点序列不一定为regular targets (an19ngg或gn19ngg)，见以下关于regular target & irregular target说明。(5) 打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，选择同源基因中碱基完全相同的区域为靶位点。(6) 把靶点序列连接到sgrna序列的5端(20 bp target)gttttagagctagaaatagcaagttaaaataa ggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt,利用在线软件(/?q=mfold/rna-fol

16、ding-form2.3)做二级结构分析。靶序列与sgrna序列产生连续配对7 bp（注意：rna可以产生u-g配对）以上会抑制其与染色体dna靶序列结合靶点，因此要避免使用连续配对7 bp以上的靶序列。3.2靶点接头设计u6/u3基因由iii型rna聚合酶转录，转录起始点是确定的碱基位置。例如，u6为g碱基，u3为a碱基。因此，由u6/u3启动子驱动的sgrna首碱基一定是g或者a。但是设计的靶序列的首碱基不一定刚好是g或者a，因此设计接头引物时需分两种情况考虑：精品.（1）如果目标区ngg(pam)上游第20碱基是a（用u3启动子）或g(用u6ac启动子），作为常规靶点(regular t

17、arget)，将a/g下游19碱基可按下图所示合成接头。常规靶点（regular target）接头（target adaptor）的形式注：接头正向引物t#-f和反向引物t#-r命名是根据靶点在sgrna表达盒的连接方向决定，不是基因方向决定，否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向; 另外注意设计引物（尤其反向引物）时的5-3方向。（2）如果ngg上游第20碱基不是a或g，作为非常规靶点(irregular target)，将20碱基为靶序列合成接头的形式非常规靶点（irregular target）接头的形式也就是说，所用启动子的转录起始点与ngg上游第20碱基相同的regular靶点

18、就是合成19碱基+4碱基粘性末端(转录产生的靶点配对序列为a/g+19 =20)；不相同的irregular靶点就是合成20碱基+4碱基粘性末端。对使用拟南芥的atu3/atu6启动子的靶点接头也是同样道理，但对接各启动子的粘性末端不同（见figure 3b）。3.3 overlapping pcr法扩增sgrna表达盒引物设计见4.1.2（与3.2相同目的，自由选择用任一个方案）4. pylcrispr/cas9打靶载体构建原理4.1靶点引物接头与sgrna表达盒的连接和扩增4.1.1 sgrna构建方法1 (接头连接扩增法，与3.2对应)：连接接头后（连接操作见步骤5-5），有3种方法扩增

19、sgrna表达盒片段（figure 4）：（1）直接用golden gate位置特异引物(table s1)做一轮pcr扩增。此方案效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物iv和产物v。精品.（2）做2轮巢式pcr，第一轮pcr用通用的u-f/gr-r做1个反应（引物序列见附录），第二轮pcr用位置特异引物扩增。此方案扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物iv和产物v（注1）。（3）做2轮巢式pcr，第一轮pcr做2个反应，分别用u-f/接头反向引物，和用接头正向引物/gr-r；第二轮为overlapping pcr,用位置特异引物扩增出表达盒产物。虽然此方案第一轮pcr需要做2个反应，但效

20、果最好且能避免扩增产物iv和产物v，因此推荐使用此方法。figure 4generation of a sgrna expression cassette by adaptor-ligation and pcr amplification在第一轮pcr加热过程中（73-75度），有缺口的引物（tm值低于u3/6和sgrna序列）先解离， u3/6和sgrna序列3端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。注1:为了提高接头连接效率，本操作中使用较高浓度（0.05 m）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接(产物ii, iii)，而环状(双端)连接(产物i)较少。另外，过度酶切，星活

21、性，过度连接等都可能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（产物iv和产物v）。4.1.2 sgrna构建方法2 （以overlapping pcr 往sgrna表达盒导入靶序列）精品.这种方法不需要用bsa i切sgrna质粒和连接反应，更加简便，不会产生上述的产物iv和v。即设计的2条靶点引物3端有15-17 nt分别与u3/u6启动子和sgrna配对，用pcr扩增出片段后进行第二轮overlapping pcr。figure 5. procedures for generation of a sgrna expression cassette containing a

22、target sequence by overlapping pcr. the chimeric primers with target sequence strands are given in table s2. the first pcr can be carried out in two separated reactions with u-f/u#t#- and grt#+/gr-r primer pair, respectively, or in one reaction with the all 4 primers. u# indicates a given promoter,

23、and t#+ and t#- indicate strands of a target sequence.精品.4.4靶标grna表达盒排列和扩增引物使用方法本系统目前使用水稻来源的4个small nuclear rna启动子的表达水平为osu6aosu6b osu6c osu3a。但打靶成功效率好像与sgrna的表达水平没有明显的相关性(即在水稻sgrna水平不是限制性因素)。当连接靶点多于4个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近（2个相邻的同向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2）。因此建议u3、u6ac启动子的使用

24、和排列方式为：1个靶点：lacz-u6a2个靶点：lacz-u6au6b3个靶点：lacz-u6au6bu6c4个靶点：lacz-u6au6bu6cu35个靶点：lacz-u6au6au6bu6cu36个靶点：lacz-u6au6au6bu6bu6cu37个靶点：lacz-u6au6au6bu6bu6cu6cu38个靶点：lacz-u6au6au6bu6bu6cu6cu3u3注：由于靶点接头5端4个碱基形成的粘性末端是根据使用的不同启动子而不同，要注意其对应关系。sgrna表达盒特定位置引物对的使用方法(t1，t2为靶序列；u#为各启动子)：1 cassette: pps-ggl/pgs-gg

25、r; 扩增相应的u#-t1-grna2 cassettes: pps-ggl/pgs-gg2, pps-gg2/pgs-ggr;扩增相应的u#-t1-grna, u#-t2-grna;精品.3 cassettes: pps-ggl/pgs-gg2, pps-gg2/pgs-gg3, pps-gg3/pgs-ggr; 扩增相应的u#-t1-grna, u#-t2-grna, u#-t3-grna;4 cassettes: pps-ggl/pgs-gg2, pps-gg2/pgs-gg3, pps-gg3/pgs-gg4, pps-gg4/pgs-ggr; 扩增相应的u#-t1-grna, u#-

26、t2-grna, u#-t3-grna, u#-t4-grna5个或以上靶点：如此类推。4.5靶标sgrna表达盒与pylcrispr/cas9载体的连接方法本载体系统可采用golden gate cloning (engler et al., 2008; 2009), gibson assembly方法(gibson, et al., 2009, 2010) 2种策略组装cas9载体和多个grna表达盒片段。golden gate ligation是利用bsa i (type iis restriction enzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性，可以设计出多种不同的且非回文结构的粘

27、性末端（256-16=240种，减去的16种是回文结构；第6-7页的pcr扩增引物使用了16种）。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接（如图6, 4个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接（相同末端分子间也不互补不能连接），因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于osu6a-lacz (atu3b-lacz) 附有lacz标记基因(198 bp)，可在含有x-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆。figure 6. generation of a 4-target construct by golden gate cloning注：由引物pps-ggl导入载体

28、的唯一spe i位点是特别留的一个“后门”。其用途是，在构建好一组目的靶点sgrna表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点sgrna表达盒，可以用spe i将载体切成线状，再用gibson assembly将第二组靶点sgrna表达盒克隆进去。如果连接较多（4个或以上）的sgrna表达盒的效率低（转化不能获得阳性克隆），就以连接产物为模板，以引物pb-l/pb-r (见table s1)扩增出连接的多个表达盒，再次与pylcrispr/cas9载体酶切连接。精品.5. 载体构建操作方法：figure 7. working flowchart for preparation of

29、 multi-target crispr/cas9 constructs（1）菌种活化和质粒提取制备：将pylcrispr/cas9菌种(top10f)和crispr/sgrna vectors菌种(dh10b)分别在含有卡那霉素（25 g/ml）和氨苄青霉素（50g/ml）平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落培养1ml种子液，再扩大培养用于提取质粒。用2-3u bsa i试切150ng质粒(10l)，电泳检查（未切的80ng质粒为对照）。注：不要将保存的菌种直接接种！关键点：pylcrispr/cas9载体较大（约1516.5 kb），拷贝数较低（pbr322复制子），用质粒小型柱提取纯化的回

30、收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如tiangen公司endofree maxi plasmid kit）提取纯化（由于溶出的质粒dna可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少dna溶液体积），或用普通碱裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在te（约0.5mg/l）保存。取部分质粒稀释成约100 ng/l冷冻保存，作为步骤（10）使用。关键点：由于接下来要用到的bsa i是很容易失活的酶，有时新买的bsa i也是失活的！在进行以下步骤之前，先检测bsa i活性：配制10 l bsa i反应液，含有5 u

31、 bsa i, 100 ng pylgrna-u#(或其它有ampr基因的质粒)。37反应15min后电泳检查，以未切的相同质粒为对照。pylgrna-u#的bsa i图谱见figure 3。为了尽可能保持酶活性，最好把bsa i分装成几管冷冻保存。neb公司的bsa i-hf经过修饰以降低星活性，精品.推荐使用neb bsai-hf和配套的cutsmart buffer。l sgrna表达盒构建方法1:（2）靶点接头制备：将接头引物te溶解成100 m母液，各取1 l加入到98 l 0.5x te混合稀释到1 m。约90 30 s，移至室温冷却完成退火。（3）sgrna载体酶切：取pylgr

32、na-osu3/lacz等质粒各1 g，在25 l反应用10 u bsa i酶切20min，冷冻保存。关键点：不要用太多酶和太长时间过度酶切！（4）sgrna表达盒连接反应：酶切过的pylgrna-osu3/lacz等质粒与各所对应接头连接反应：成分加入量终浓度(量)10t4 dna ligase buffer1 l1pylsgrna-u#质粒0.5 l1020 ng接头0.5l0.05 mt4 dna ligase(takara)0.05 l18 uddh2o补足到 10 l室温（20-28）连接约10-15 min关键点：过多dna ligase和过长时间连接会产生较多第6页所述产物iv

33、&v。注：不同公司的t4 dna ligase单位的定义和标定单位不同，如takara的350u/l，neb的400 u/l，但绝对活性单位/l都接近，即每1015 l反应大致使用0.050.1 l酶。上述步骤（3），（4）酶切和连接二步反应可用一步酶切-连接反应（边切边连法）替代：配制10 l 1x bsa i酶切连接（restriction-ligation）反应液：在1x bsa i-酶切buffer中加入atp至终浓度0.51.0 mm（此buffer对bsa i和ligase都有效），加入约1020 ng pylgrna-u#质粒（预先配好20 ng/l保存），0.5 l接头（最终浓

34、度0.05 m），35 u bsa i，15 u t4 dna ligase。如果实验室没有atp，在1x内切酶buffer中加入0.5-1.0 l 10 x neb t4 dna ligase buffer（10x neb t4 dna ligase buffer中含有10 mm atp, 但10x takara t4 dna ligase buffer中含有1.0 mm atp，因此优先用neb的）。注意：没有加内切酶buffer而单纯加t4 dna ligase buffer缺少kcl或nacl，不适合bsa i酶切！）。用变温循环仪（或pcr仪）循环反应5循环：37 5 min，20

35、5 min。（5）第一轮扩增：每个sgrna表达盒分为2个pcr反应，各15 l反应体系：取0.5 l连接产物为模板，使用第6页引物u-f/接头反向引物（反应1），和接头正向引物/gr-r（反应2），各0.2m,适量高保真pcr酶。25-28循环：94 10s，60 15s ，68 20 s。(任意) 取4 l电泳检查（反应2产物长度约140 bp，用2%琼脂糖胶）。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮pcr。注：虽然用第二轮pcr的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物，但用2轮pcr扩增可以更稳定地得到特异性目标产物且能避免空载产物扩增，见figure 4。关键点：最好使用kod-p

36、lus (toyobo)，保真度最高且性价比高，或kod fx。不要使用能在产物3附加a碱基的dna聚合酶，此a碱基使产物在第二轮pcr中不与互补链配对而不能延伸补平）。（6）第二轮pcr：精品.按附录1通用引物所述，预先将位置特异引物对混合成10工作液，每种1.5 m：引物组合1个靶点：pt1r；2个靶点：pt1，pt2r；3个靶点：pt1，pt2，pt3r;4个靶点：pt1，pt2，pt3，pt4r;5个靶点：pt1，pt2，pt3，pt4，pt5r;6个靶点：pt1，pt2，pt3，pt4，pt5，pt6r；7个靶点：pt1，pt2，pt3，pt4，pt5，pt6，pt7r；8个靶点：p

37、t1，pt2，pt3，pt4，pt5，pt6，pt7，pt8r取第一轮pcr产物1 l用h2o稀释10倍，各取1 l混合为模板。各表达盒20-50 l pcr (1个靶点50 l； 2-3个靶点各30 l；4个或以上靶点各20 l)。加入1/10量每种引物组合工作液（最终浓度0.15 m）。使用适量kod-plus或其它高保真pcr酶。扩增17-20循环(实际情况调整)：95 10s，58 15s，68 20 s。取2 -3 l电泳检查产物长度是否符合（注1），并估计样品的大致浓度。注1：各种启动子grna表达盒的长度为（括号为bsa i切后）：单子叶表达盒pcr扩增产物长度（bp）bsai酶

38、切后长长度（bp）双子叶表达盒pcr扩增产物长度（bp）bsai酶切后长度（bp）lacz-osu6a-grna831801lacz-atu3d-grna486456osu6a-grna629599atu3d-grna284254osu6b-grna515485lacz-atu3b-grna709679osu6b-grna924894atu3b-grna507477lacz-osu3-grna766736atu6-1-grna487457osu3-grna603573atu6-29-grna502472（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用pcr产物纯化kit

39、纯化。关键点：此步骤是为了除去dna聚合酶，以防止下面步骤bsa i酶切产生的粘性末端被补平。l sgrna表达盒构建方法2 (overlapping pcr):（8）取2-5 ng pylgrna-osu#质粒为模板，在一个反应中使用4种引物：u-f和grt#+ 各0.2 m，u#t#-和grt#+（table s1）各0.1 m。25-28 循环：94 10s，58 15s ，68 20 s。 在扩增过程中，开头的若干循环时u-f/u#t#-扩出u#-t#序列，gr-r/grt#+扩出t#-sgrna序列。后期的循环中通过overlapping pcr产生2个片段合并的sgrna表达盒片段

40、。(9) 取第一轮pcr产物1l用h2o稀释10倍，取1 l为模板，按以上步骤（6）进行第二轮pcr。l 组装sgrna表达盒到pylcrispr/cas9载体 (策略i, golden gate cloning)：(10) 酶切-连接反应精品.试剂加入量（l）终浓度10cutsmart buffer1.5110 mm atp1.51 mmpylcrispr/cas9质粒60-80 ng4-6 ng/lsgrna表达盒混合物每表达盒10-15 ng bsa i-hf10 u0.1-0.2 u/lt4 dna ligaseh2o35 u最终15l2-3 u/l注：每个靶点约10-15 ng (如

41、1个靶点约10 ng、 2个靶点共20-30 ng、 3个共约40-50 ng、 4个共约60-70 ng、更多靶点时每个片段的量适当增加（最多15 ng/片段）。这样载体与每种插入片段摩尔比=1: 4-6。用变温循环进行酶切连接约10-15循环: 375 min；105 min，20 5 min；最后375 min。此方法简便效率高，阳性克隆率高，推荐优先使用。冷冻保存未用完的连接产物，有必要时做下一步扩增用。注：也可以用常规的先切后连法（供参考）：取约2-3 g pylcrispr/cas9-mh (b) 在50 l（30u bsai）酶切30 min, 用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段（

42、去除ccdb片段）（不要用太多酶或太长时间过度酶切）。用0.5x te洗回收胶30分钟，65 3 min熔解，在40 加入agarase（1u/100l胶， neb)处理30分钟后，分装成每管40-60 ng（2-3 l）冷冻保存公用（一管做一次连接，以避免多次冻融）。在切好分装（步骤2）的pylcrispr/cas9 (约60-80ng）管中，加入已用bsa i酶切好的pcr产物（每个靶点约10-15 ng），在10 l 连接反应（加35 u连接酶）， 16 （或最好用变温循环: 10 5min，20 5 min；10-15循环）连接2-3 h（不要过长时间连接）。l 连接效率低的补救方法：

43、（11） 如果连接较多（4个或以上）的sgrna表达盒的效率低,即连接产物直接转化后不能获得阳性克隆，就用步骤（10）的0.2-0.5 l连接产物为模板(直接转化得不到阳性克隆的连接产物也可以作为扩增模板，因为很少的连接分子就足够被扩增了)，以table s1的引物pb-l/pb-r扩增（40 l，用kod fx）(如果使用旧说明书的位置特异引物，pb-l/pb-r要改为pb-lo/pb-ro (见table s1说明)。为提高扩增特异性，用热启动：先不加引物，在反应温度达到80度以上时介入引物（最终0.2 m）。10循环：97c 10 s; 60c 20 s; 68c 3-5 min (延伸

44、时间按40 s/1 sgrna或 1 min/1kb) ;再15循环（循环数可调整）：97c 10 s; 68c 3-5 min。电泳回收目标片段（扩增产物可能会有非特异小片段）。取约20-30ng产物与50-60 pylcrispr/cas9按以上步骤（10）再酶切与连接。注：pb-l/pb-r位于双元载体与sgrna表达盒的连接点(figure 4)。（12）连接产物转化（电激法）：将连接产物滴载在悬浮式透析膜millipore vswp04700（0.025 m孔径）对0.2 x te透析1530 min（最好在4冷柜内）透析脱盐（注1）。取1-1.5 l连接产物电激转化e. coli

45、dh10b感受态细胞（注2），电激后加入1 ml soc，37培养1-1.5 h。涂板培养基为lb+ 25 g/ml kan, 0.30.5 mm iptg(注3)，适量x-gal。iptg诱导没有彻底切除ccdbs的空载质粒转化子的ccdbs表达致死。而含有目标插入序列（lacz-osu3-grna表达盒）的阳性克隆由laczs表达产生蓝色菌斑（注4）。注1：或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，风干溶在5 l 去离子水。精品.注2：化学热激法转化也可以获得阳性克隆，但效率较低。因此，有电激仪的实验室应该使用电激法。虽然其它菌株也可以用，但dh10b更适合高效率电激转化大质粒。电激转化感受体态细胞制备

46、最好用sob培养（不要用lb培养），以10 pg puc18质粒转化测试转化效率（小质粒用电激电压1800 v/20l感受态细胞/1l电激杯），要求达到效率109 colonies/1g puc18(即电激10 pg质粒，涂1/20 转化细胞出500以上菌斑)。15kb大质粒的电激电压为1500-1600 v/20l感受态细胞/1l电激杯（或2500v/40l感受态细胞/2l电激杯）；注3：使用lac iq基因型菌种用1.0 mm注4：注意：白色且生长大小正常的菌斑是已切除ccdbs但末端破坏平端连接的空载克隆，或ccdbs功能突变（有约1/1000频率发生）但未切除ccdb的空载克隆。（13

47、）提取质粒，mlu i酶切电泳检测sgrna表达盒连接片段。如果mlu i酶切带型有疑问，用asc i酶切确认。（如果做以下步骤测序，可不做这个pcr检测）取少量（13ng）质粒为模板对所有靶点进行pcr检测(也用空载质粒做阴性对照)。引物配对形式为：sp-dl引物与第一靶点接头反向引物配对；第一靶点接头正向引物与第二靶点反向接头引物配对；第二靶点正向接头引物与第三靶点接头反向引物配对；第三靶点接头正向引物与第四靶点反向接头引物配对；如此类推，最后靶点正向接头引物与sp-r引物配对。这样每个靶点的正反方向都检测过一次。电泳确认其大小是否符合预期。（14）测序检测(如果步骤13确认了，可以不做此

48、测序)：利用各靶点引物的特异性，按下图方式对特定靶点进行测序。figure 8. strategy for sequencing of the linked sgrna expression cassettes注：最好提醒测序公司，这是中低拷贝的较大质粒，以便公司采取相应措施。注：由于osu6c比较长（742bp），用前一个靶点正向引物不一定能测通osu6c到靶序列（t#），如果osu6c是最后一个表达盒，要用sp-r (见第2页)进行测序；如果u6c不是最后一个表达盒，用其后面的靶点反向引物测。（15）导入农杆菌。获得的克隆电激转化农杆菌（eha105）。在农杆菌的稳定性检测（可以不做）：从

49、农杆菌提取质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做pcr），取约2-5ng质粒为模板再用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行pcr确认。可选步骤：或将质粒转化dh10b，再挑取单克隆培养，并提取质粒酶切分析。(16) 获得的阳性农杆菌可用于侵染植物组织。(17) 获得转基因植株的打靶效果检测：打靶成功的转化体往往在靶点产生单碱基插入或者缺失若干碱基。以t0植株靶点为中心，在两侧各离开约150-200 bp处合成引物，pcr产物直接测序。如果出现单个碱基是精品.杂合峰，可以判断2个等位基因型；如果从某个碱基以后全部是重叠峰峰，表明是杂合突变或双等位突变，可按ma et al., 2015 (mo

50、l. plant 2015, doi: /10.1016/j.molp.2015.02.012)方法进行解码；如果测序峰图无杂峰，而在靶点位置序列出现差异，可以判定为纯合突变。注1：拟南芥t1代有相当多嵌合突变和杂合突变，后代分离可能不符合孟德尔分离比，还会出现新的突变。附录1 本附录列出了使用本载体系统所必需的部分材料。其它常规分子克隆需要的材料没有列出。菌种：大肠杆菌top10f，用于pylcrispr/cas9系列载体的繁殖，如果我们已经提供了含有质粒的菌种，则不需要准备。大肠杆菌dh10b或dh5a或其他常用克隆用菌种，用于克隆载体；农杆菌eha105或

51、者其他农杆菌，用于转化水稻，拟南芥等植物；酶：bsai-hf (neb, cat. no. r3535);mlu i (takara, cat. no. d1071);kod plus (toyobo, cat. no. kod-201); kod fx (toyobo, cat. no. kfx-101);golden gate克隆通用引物：table s1. primers used for golden gate cloning of sgrna expression cassettes. positionprimersequence (5-3)1st pcru-fctccgttttac

52、ctgtggaatcggr-rcggaggaaaattccatccac2nd pcrsite b-lsite 2pps-gglttcagaggtctctctcgactagtatggaatcggcagcaaaggpgs-gg2agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctcsite 2site 3pps-gg2ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaaggpgs-gg3agcgtgggtctcgtcttcactccatccactccaagctcsite 3site 4pps-gg3ttcagaggtctctaagactttggaatcggc

53、agcaaaggpgs-gg4agcgtgggtctcgagtcctttccatccactccaagctcsite 4site 5pps-gg4ttcagaggtctctgactacatggaatcggcagcaaaggpgs-gg5agcgtgggtctcggtccacatccatccactccaagctcsite 5site 6pps-gg5ttcagaggtctctggactagtggaatcggcagcaaaggpgs-gg6agcgtgggtctcgcagatagtccatccactccaagctcsite 6site 7pps-gg6ttcagaggtctcttctgcaatgga

54、atcggcagcaaaggpgs-gg7agcgtgggtctcgacctcaatccatccactccaagctcsite 7site 8pps-gg7ttcagaggtctctaggtttctggaatcggcagcaaaggpgs-gg8agcgtgggtctcgagcgttctccatccactccaagctcsite 8site b-rpps-gg8ttcagaggtctctcgctgattggaatcggcagcaaaggpgs-ggragcgtgggtctcgaccgacgcgtatccatccactccaagctc精品.flankingprimers pb-lpb-rgcgc

55、gcggtctcgctcgactagtatgggcgcgcggtctctaccgacgcgtatcc（1）the bsa i-cutting non-palindromic ends with the same color are compatible for ligation.（2）actagtandacgcgtare spe i and mlu i sites, respectively.（3）if more sgrna expression cassettes are needed, new primer sets can be designed with distinct bsa i-

56、cleaving sites. （4）table s1的位置特异引物与旧说明书的引物相比，改了引物名并有少量修改。旧说明书的引物可以继续使用，但如果要pcr扩增连接产物，pb-l/pb-r要改为：pb-lo: ggcgcgcggtctcgctcgactagtg-3； pb-ro: gcgcgcggtctctaccgacgcgtcca-3。table s2. primers used for introduction of target sequences into sgrna expression cassettes by overlapping pcr.primersequencegrt#+(n19 or n20)gttttagagctagaaat-3osu6at#-(n19 or n20)cggcagccaagccagca-3osu6bt#-(n19 or n20)caacacaagcggcagc-3osu6ct#-osu3t#-(n19