第04章复制.ppt

1、DNA的复制 (生物合成) Replication ， DNA Biosynthesis,第 四 章,本章内容,第一节 DNA复制的酶学 第二节 DNA生物合成过程 第三节 DNA复制的基本规律 第四节 逆转录,中心法则（The central dogma）,1/62,复制(replication) 是指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程。,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,目 录,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,参与DNA复制的物质,模板(template) : 解开成单链的DNA母链 底物(

2、substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol 其他的酶和蛋白质因子,DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication,第一节,一、DNA复制的酶学,（一）解螺旋酶（helicase） 可以将DNA双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。 蛋白质（基因） 通用名 功能 DnaA 辨认起始点 DnaB 解螺旋酶 解开DNA双链 DnaC 协同和运送DnaB,E. Coli 基因

3、图,目 录,一、DNA复制的酶学,（一）解螺旋酶（helicase） 可以将DNA双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。 蛋白质（基因） 通用名 功能 DnaA 辨认起始点 DnaB 解螺旋酶 解开DNA双链 DnaC 协同和运送DnaB,（二）DNA单链结合蛋白,（single chain binding protein-SSB） 可以维持模板的单链状态并保护模板不 受核酸酶的降解。随着DNA双链的不断解开， SSB能不断的与之结合、解离。,3,5,3,5,解链过程中正超螺旋的形成,目 录,（三）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),拓扑异构酶作用 通过切断

4、并连接DNA双链中的一股或双股，改变DNA分子拓扑构象，避免DNA分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,（四）引物酶（primase） 是一种RNA聚合酶，在复制的起始点处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。引物酶能直接在单链DNA模板上催化游

5、离的NTP合成一小段RNA，并由这一小段RNA引物提供3-OH， 经DNA聚合酶催化链的延伸。,E. Coli 基因图,目 录,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,（五）DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性 2. 53 核酸外切酶活性 3.35 核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,1. 原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol

6、,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),原核生物的DNA聚合酶,2. 真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,

7、起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,（六）DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具

8、酶之一。,功能,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第二节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,A G G T A C T G C C A C T G G,T C

9、C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,亲代DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目 录,链的延伸,前导（领头）链和冈崎片的形成,（二）复制的延长,复制的

10、延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,参与DNA复制的物质,模板(template) 方向: 3 5 合成方向: 5 3 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段 核酸片段提供3OH末端。 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP DNA聚合酶(polymerase):DNA pol III,OH 3,3,目 录,领头链的合成,随从链的合成,领头链 (leading strand),随从链 (lagging

11、 strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,目 录,复制过程简图,目 录,复 制 过 程 动 画,链的终止,引物的切除和缺口的填补 随从（滞后）链DNA片段的连接,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,目 录,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,

12、S,M,二、真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 真核生物 DNA的复制只发生在S期。 S期是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体。, 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制

13、起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目 录,目 录,切除引物的两种机制,目 录,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,

14、hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目 录,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,目 录,复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication,第三节,复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication) 复制的高保真性(high fidelity) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),一、半保留复制的实验依据和意义,

15、DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T

16、 A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目 录,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定

17、性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、复制的半不连续性,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。 另一股

18、链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,四、DNA复制的保真性,（一）酶学依据： 1.核酸外切酶活性和校读； 2.复制的保真性和碱基选择 （二）机制： 1.遵守严格的碱基配对规律； 2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能； 3.复制出错时有即时的校读功能,1. DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现

19、活性。,2. 复制的保真性和碱基选择, DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription,第四节,一、概念,逆转录(reverse transcription)指遗传信息从 RNA流向DNA，是RNA指导下的DNA合成过 程，即以RNA为模板，四种dNTP为

20、原料，合 成与RNA互补的DNA单链。,二、逆转录酶(reverse transcriptase),催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA 病毒中都含有此酶。 具有三种酶活性： RNA指导的DNA聚合酶 RNA酶 DNA指导的DNA聚合酶,三、合成过程,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,四、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有

21、遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,滚环复制(rolling circle replication),五、滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制,目 录,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,DNA损伤、修复与突变 DNA Damage、 Repair and Mutation,第五章,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射,化学因素,目 录,三、突变的分子改变类型,错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement),DN