第二章之种子培养.ppt

1、微生物菌种的扩大培养,李尊华 2009. 9,第一节 种子制备工艺,放罐，后处理,产品,一级种子发酵罐,二级种子发酵罐,种子扩大培养概念：,将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。,种子质量的优劣对发酵生产起关键作用。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。,发酵罐(几十或几百立方米),按10%接种量,种子液(几或几十立方米),由实验室制备到车间生产 的过程,作为种子的要求： 1) 菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短 2) 生理性状稳定 3) 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 4) 无杂

2、菌污染 5) 保持稳定的生产能力,一、 实验室种子制备,接入斜面/平板，培养成熟后，挑选孢子，再一次接入斜面/平板，进行活化。(两次转接),A、砂土管或冷冻干燥管菌种活化,可采用固体培养基培养孢子，直接作为种子罐的种子。 举例:产黄青霉菌，采用大米或小米为固体培养基，装入摇瓶、灭菌，耍注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接入孢子，25-28培养14d。培养结束，将孢子瓶于真空下抽去水分，使含水量10以下，冰箱保存备用。,B、产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种,可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。,C、产孢子能力不强或

3、孢子发芽慢的菌种,生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32，培养18-24 h，即可移入250mL摇瓶液体培养基，32 培养12 h，即可作种子罐种子。 例如：谷氨酸棒状杆菌。,D、不产孢子的细菌,一般保存在麦芽汁琼脂培养基或MYPG培养基的斜面上，4冰箱保存.每年移种3-4次。 斜面菌种接入含10mL麦芽汁试管25-27培养2-3d扩大至三角瓶25培养2d移至含5-10L麦芽汁的罐15-20培养3-5d含100L麦芽汁的发酵罐。,E、生产啤酒的酵母菌,MYPG培养基：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨, 10g葡萄糖,20g琼脂,1L水。,二、生产车间种子制备,采用易被菌利

4、用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。,种子罐培养原则：,摇瓶菌丝体种子： 种子罐之间或发酵罐间的移种：,接种方法：,可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接入。,主要采用压差法，由种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降至零.,Why?,从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种种子罐,种子罐,种子罐,从种子罐接种到发酵罐,生产车间种子制备工艺可控参数:,种子罐级数,种龄,接种量,A 种子罐级数的确定,种子罐级数指制备种子需扩大培养的次数.,种子罐级数的意义： 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少

5、移种带来染菌机会。 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜过少。,种子罐级数随菌种及规模而定，也与工艺条件有关。 优化种子罐培养条件，加速孢子发芽及菌体繁殖，也可减少种子罐的级数。,1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。 例如：谷氨酸生产中，菌接入种子罐32培养7一10h，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。,2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。 例如：青霉素孢子悬液接入一级种子罐（发芽罐）于27培养40h，孢子发芽，长出短菌丝。再移至第二级种子罐（繁殖罐），

6、27培养10-24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。,3.生长更慢的菌种 链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养。 在小型发酵罐(530L)进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵，称一级发酵。,接种龄以菌丝处于对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。 过于年轻的种子：前期生长缓慢、发酵周期延长、产物形成推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况。 过老的种子：会引起生产能力下降，菌丝过早自溶。 不同品种或同一品种的工艺条件不同，接种龄是不一样的，要经试

7、验，确定最适接种龄。,B 接种龄,嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。,移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 接种量大小决定于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。,例如：抗生素发酵的最适接种量为7-15，有时可增加到20-25。而谷氨酸发酵只需1。,C.接种量,大接种量： 可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前，且生产菌迅速繁殖，可减少杂菌生长机会。 原因：? (a、种子量多 b、种子液含大量水解酶类，利于利用基质),接种量过多： 往往使菌丝生长过快、培养液粘度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。,嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶： 1接种量产酶活力最高，超过4酶产量

8、明显下降。,接种量过小： 除了延长发酵周期外，往往还会引起其他不正常情况。 例如：在头孢菌素生产中，由于接种量过小，会产生大量菌丝团，而使产量降低， 但有的抗生素如制霉菌素，用1接种量比用10接种量的效果好，而0.1接种量与1的效果相似。,近年来，生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。 双种法：有的产品采用二只种子罐接一只发酵罐，如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8，而且达到产量高峰的时间提前。 倒种法：即以适宜的发酵液倒出适量，给另一发酵罐作种子例如链霉素发酵中，使用倒种法比单种的发酵单位提高12。而四环素发酵采用双种效果并不显著。,影响种子质量的因素 种子质量的

9、判断 种子质量的控制,第二节 种子质量的控制,A 原材料质量 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。(什么引起原料质量波动?),影响种子质量的因素,答：原材料质量的波动，起主要作用的是无机离子含量不同，如微量元素镁、铜、钡能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。,例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。 例2：制备霉菌用的大(小)米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。 例3：蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同。 例4：琼脂的牌号不同，其中含无机离子的差别而

10、引起孢子质量的变化。 例5：水质的硬度、污染程度对生产均有影响。,B 培养条件 (1)温度 对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。 例如：土霉素生产菌种在高于37培养时，孢子接入发酵罐后，表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。,(2)湿度 斜面培养基湿度对孢子数量和质量有较大影响。 例如：土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子制备时发现： 北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含少量水分的试管斜面下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少。 在气温高湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。,(3) 通气量 种子罐有足够的通气量可以

11、提高种子质量。 例如: 青霉素生产，将通气充足和不足情况下得到的种子分别接入发酵罐，发酵单位相差1倍。 但也有例外 例如：土霉素生产中，一级种子罐的通气量小对发酵有利。,C 斜面冷藏时间 例如：土霉素生产菌种，孢子斜面培养4d即于4冰箱保存，冷藏7-8d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。,例如：链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18。,斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。,冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。,为保证种子质量，除保证培养条件外，还要定期取样测定一些参数，以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正常。,1).pH 2).培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量 3).菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等) 4).其他参数，如接种前抗生素含量、某种酶活力等,种子质量的判断,测定的参数:,用酶活力来判断种子的质量是一种新的尝试： 例如：土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。淀粉酶活力高的，接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。,A 菌种稳定性的检查 生产菌种，必须保持稳定的生产能力，虽然菌种保藏在休眠状态的环境中，但微生