Alltech 2000型蒸发光散射检测器解决任何HPLC检测难题.ppt

1、,ELSD检测器的选择和主要的应用介绍,GRACE,格雷斯公司探索科技, Davison 从分析到制备的解决方案,美国奥泰公司(Alltech)于2004年8月并入Grace公司，隶属于三大 分支之一的Davison旗下的探索科技部门。 Davison是全球最大的硅胶生产商，能够为LC,GC和LC的应用提供从小规模研发到大规模工业生产的一站式解决方案。,HPLC和GC柱，配件和仪器,硅胶基色谱填料,HPLC毛细柱和微径柱,HPLC柱和小型仪器,制备级和工业级LC柱和装柱服务,生物分离专用HPLC柱和填料,GRACE,大纲,常规检测器的回顾 ELSD的检测原理 ELSD与常规检测器的比较 ELS

2、D在分析上的优点 Alltech ELSD的介绍 ELSD的维护 质量保证 总结,GRACE,其它检测器的介绍,紫外可见UV/Vis 示差折光RI 荧光Fluorescence 质谱Mass Spectrometry,GRACE,检测器是高效液相色谱（HPLC）的核心部件之一，被喻为HPLC的眼睛。它的作用是将色谱柱流出物中样品含量的变化转换为可供观测的信号，通常是转换为电信号，以便自动记录下来进行定性定量分析。,检测器的应用分布,紫外可见 65%,示差和蒸发光10%,电化学10%,荧光8%,质谱4%,其它3%,GRACE,紫外/可见检测器UV/VIS,优点： 易于操作 可靠性 费用相对低廉

3、溶剂梯度兼容 对样品没有破坏性 相对灵敏度高,GRACE,局限性： 没有好的发光基团 的化合物响应较差 溶剂的使用上受紫外截止波长的限制,荧光检测器Fluorescence,优点： 很好的灵敏度 很好的选择性 受流速和温度的变化影响很小,GRACE,局限性： 线性范围窄 操作复杂-需要对化合物和仪器的变化了解透彻 某些物质如氧气会熄灭荧光-必须严格脱气 能够自然产生荧光的化合物不是很多 衍生方法复杂,示差折光检测器RI,优点： 通用性-对几乎所有的物质具有相应 宽的动态线性范围-104 易于操作,GRACE,局限性: 检测灵敏度不高 对于温度和压力的波动敏感 平衡慢 检测既有正峰也有负峰 不能

4、进行梯度洗脱 流动相预先混合后的效果好于泵在线混合的,质谱 MS,优点: 灵敏度高 选择性好 提供化学结构信息,GRACE,局限性: 购买费用高 操作复杂 需要经常维护 定量分析困难,蒸发光散射检测器ELSD,发展历史 检测原理 局限性 优点 在分析中的应用,GRACE,发展历史:,第一台商业化的产品出现在80年代初期 最早的应用集中在聚合物的分析上 90年代初期，更多其它方面的应用 目前,应用在广泛的领域,GRACE,ELSD行业超过20年的领先制造经验:,GRACE,500 型,2000 型,800 型,2000ES型,3300 型,独特的检测方法：,检测三部曲: 雾化 溶剂的蒸发 检测,

5、GRACE,ELSD可以对所有挥发性低于流动相的物质作出准确检测，而与被检测物质的化学基团关系不大，物理性质类似的物质响应一致，响应值与样品的质量成正比。,第一步：雾化,色谱柱流出物通过喷雾器针孔 与氮气混合 形成均匀的雾状液滴(气溶胶),GRACE,第二步：溶剂的蒸发,液滴通过加热的漂移管 流动相蒸发 干燥的样品颗粒保留,GRACE,第三步：检测,样品颗粒通过流动池 激光“撞击”颗粒被散射 光电二极管检测散射光 检测角度为90，避免虚假 信号(90折射/衍射光；90反射光),GRACE,两种类型气溶胶处理方式：,A型-所有液滴进入漂移管及流动池(又称为“无气溶胶分流 No Aerosol S

6、plitting”) B型-部分液滴分流排掉；只有一部分进入漂移管及流动池(“气溶胶分流Aerosol Splitting”),GRACE,A型ELSD-气溶胶不分流操作,所有样品从喷雾器进入漂移管及流动池 需要较高温度才能完全蒸发流动相； A型ELSD只有不分流一种操作模式,GRACE,B型ELSD-气溶胶分流操作,部分样品被排掉 较低的温度已足够蒸发所有溶剂 B型ELSD只有分流一种操作模式,GRACE,Alltech 2000(ES)型ELSD,唯一提供两种操作模式的ELSD，在任何流动相及样品分析条件下均达到最佳结果,GRACE,一台仪器，两种操作模式：,撞击器(Impactor)关-

7、所有液滴进入漂移管及流动池(A型ELSD-无分流) 撞击器(Impactor)开-部分液滴被排除，只有一部分进入漂移管及流动池(B型ELSD-气溶胶分流) 采用新型专利“气溶胶分流技术” US Patent #6229605,GRACE,撞击器关模式,撞击器与气溶胶流向平行 所有样品流过漂移管到达流通池 最适用于非挥发性样品及挥发性溶剂(大部分为有机),Drive Shaft,Nebulizer,Optics,Impactor Off,GRACE,Nebulizer,Drive Shaft,Impactor Off,Optics,Exhaust,Drift Tube,Nebulizer,Imp

8、actor,Drain,撞击器开模式,撞击器垂直于气溶胶流向，部分液滴碰上撞击器从废液管排掉;其余穿过撞击器，经过漂移管到达流动池 最适用于半挥发性样品及低挥发性溶剂(大部分为水溶液),Drive Shaft,Nebulizer,Impactor On,Optics,GRACE,Nebulizer,Drive Shaft,Impactor On,Nebulizer,Drain,Impactor,Drift Tube,Exhaust,Optics,撞击器关-最适合非挥发性样品,Column: Alltech 700CH Carbohydrate Column 10m, 300 x6.5mm Mo

9、bile Phase: 100% Water Flowrate:0.5mL/min,1. 蜜三糖 (50g/mL) 2. 乳糖(50g/mL) 3. 葡萄糖 (50g/mL) 4. 甘露糖 (50g/mL),Column: Alltech 700CH Carbohydrate Column 10m, 300 x6.5mm Mobile Phase: 100% Water Flowrate:0.5mL/min,# 9206,# 9205,Impactor On,Impactor Off,碳水化合物,非挥发性样品在撞击器“关”的情况下也不挥发，全部进入流动池，得到最高灵敏度,GRACE,撞击器关-

10、最适合挥发性溶剂,有机溶剂在较低温度蒸发，在撞击器“关”的情况下，也会完全蒸发，B型ELSD 任何条件下均分流，造成样品损失，降低检测灵敏度,Column: Alltech Econosphere, C18, 5m, 150 x 4.6 mm Mobile Phase: Methanol:Water (90:10) Flowrate:0.8mL/min,Column: Alltech Econosphere, C18, 5m, 150 x 4.6 mm Mobile Phase: Methanol:Water (90:10) Flowrate:0.8mL/min,1. n-癸基-b-D-吡喃糖

11、苷 (5g/mL) 2. n-辛基-b-D-吡喃糖苷 (5g/mL) 3. n-十二烷基-b-D-吡喃糖苷(5g/mL),葡萄糖苷分析,Impactor On,Impactor Off,# 9180,# 9179,GRACE,撞击器开-最适合半挥发性样品,在撞击器开情况下，可以较低温蒸发溶剂，防止半挥发性样品蒸发,防腐剂分析,Column: Alltech Econosphere, C18, 5m, 150 x 4.6 mm Mobile Phase: Methanol:Water (90:10) Flowrate:0.8mL/min,Column: Alltech Econosphere,

12、C18, 5m, 150 x 4.6 mm Mobile Phase: Methanol:Water (90:10) Flowrate:0.8mL/min,1. 羟基苯甲酸甲酯 2. 羟基苯甲酸乙酯 3. 羟基苯甲酸丙酯 4. 羟基苯甲酸丁酯,# 9202,Impactor Off,Impactor On,# 9201,GRACE,撞击器开-在几乎室温下检测半挥发样品,Column:Prevail Carbohydrate ES, 5m, 250 x 4.6mm Mobile Phase: Acetonitrile: 0.04% Ammonium Hydroxide (80:20) Flowr

13、ate: 1.0mL/min,1.Glycerol甘油,GRACE,ELSD的局限性,1. 只能使用挥发性的流动相 2. 样品的挥发性必须要小于流动相 3. 检测器响应是非线性的,GRACE,挥发性的流动相改性剂#1,GRACE,挥发性的流动相改性剂#2,GRACE,载气流速与漂移管温度,GRACE,载气流速和漂移管温度是ELSD中可以调节的两个重要参数，建立适当的HPLC-ELSD分析方法需要对这两个参数进行优化。 优化的原则是降低噪声到可以接受的程度，并尽量提高信噪比。,载气流速与漂移管温度,GRACE,漂移管温度对基线水平和噪音的影响并无明显的规律性。低于某一温度，基线水平较高，因为低于

14、这一温度，流动相得不到充分挥发，而盐的加入将会提高这一温度，因为盐的挥发需要更高的温度，但并不是漂移管温度越高越好，因为温度太高会使流动相沸腾，反而会增加背景噪音，同时还有可能导致溶质的部分挥发，降低信噪比。 故最优温度应为在流动相（包括其中所含的盐）基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温度,载气流速与漂移管温度,GRACE,一般来说，在其它条件不变的情况下，载气流速越小，形成的物质粒子半径越大，对激光的散射能力越强，相应的响应信号越大。但并不是载气流速越小越好，因为当载气流速太小时，流动相不能完全挥发，背景噪音会增加，信噪比也会降低。 最优载气流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应

15、值时的最低流速。,如何应对非线性响应的检测器？,选择2阶方程或者幂指曲线方程 使用曲线的仅仅线性部分 使用log/log 双对数方法产生线性曲线 即:对照品的浓度和面积同时取对数,至少两个点得到直线方程 在中国药典2005版中，中药计算采用两点双对 数方法,抗生素计算采用三点双对数方法,GRACE,散射光的响应值与粒子质量的关系： Ikmb 取对数： lgIblgmlgk m：待测组分的粒子质量和 I： 待测组分所产生的散射光光强 k,b：常数,Log-Log线性方程,GRACE,ELSD-功能强大的HPLC检测器,通用性高-可检测任何挥发性低于流动相 的化合物 灵敏度好-比示差及低波长紫外灵

16、敏 一致的响应-给出准确的样品浓度 用途广泛-梯度相容，改善分离及缩短分析时间,GRACE,ELSD响应因子的一致性,GRACE,不同的物质在蒸发光散射检测器中几乎具有相同的响应因子，这种响应因子的一致性，使纯度分析结果和多组分物质的相对比例测定结果更准确。 在无合适对照品的情况下，采用另外一种含量已知的物质作内标，测定未知物含量成为可能。这一点对组合分子库、无紫外发色团物质的新药基准品的建立尤为有用。,ELSD比较其它几种检测器的优势,示差 RI 紫外可见 UV/Vis 荧光Fluorescence 质谱MS,GRACE,ELSD相比示差的优势:,示差检测器的限制ELSD优点,温度变化会引起

17、基线不稳定,不受环境温度影响,可能出现负峰,均是正峰,不可以用梯度洗脱,梯度洗脱兼容,受溶剂峰干扰,溶剂无响应，无溶剂峰,灵敏度差,ng级的检测限,GRACE,ELSD不会出负峰,五糖, 1.5mg/mL,ELSDRIRI (反转极性),GRACE,ELSD相对RI，提高了检测灵敏度和基线稳定性,RI,ELSD,10277,10278,1.Fructose 果糖 2.Glucose 葡萄糖 3. Sucrose 蔗糖,Column: Prevail Carbohydrate ES, 5m, 53 x 7mm (Part No. 35104) Mobile Phase: Acetonitrile

18、:Water (75:25) Flowrate: 2.0mL/min Column Temp: 30C,GRACE,碳水化合物的梯度洗脱,# 7576 (Isocratic),1. 核糖 2. 木糖 3. 果糖 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6. 麦芽糖 7. 乳糖 8. 棉子糖,1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 麦芽糖 5. 乳糖,# 7570 (Gradient),Carbohydrates,GRACE,ELSD相比紫外检测器的优势:,UV的局限性 ELSD的优点,只能检测吸收紫外或可见光 检测挥发性低于溶剂的任的化合物何化合物 检测基于样品的消光系数 检测基于样品浓度 低波长紫外检

19、测作梯度洗脱时梯度洗脱时基线稳定 出现基线漂移 溶剂峰会干扰 溶剂没有响应，无溶剂峰 溶剂选择受其紫外末端吸收限制可用任何挥发性的溶剂,GRACE,甾体化合物,# 7941,1. 雌酮-3-硫酸钠, 100ng 2. b-雌二醇-17- b -D-葡萄糖苷酸钠, 100ng 3. 5b -孕烷-3a,20a-二醇-葡萄糖酸苷, 220ng,# 7940,Column: Alltima C18, 5m, 150 x 2.1mm (Part No. 88370) Mobile Phase:A: 0.1% TFA in Water B: 0.1% TFA in Methanol Gradient:

20、Time:01018 %B:60100100 Flow Rate: 0.2mL/min,GRACE,10446,ELSD显示在UV谱图中未检测到的成分,Lotrimim AF Topical Solution,1. PEG 2. Clotrimazole,Column: Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mm (Part No. 88302) Mobile Phase:A: Water B: Methanol Gradient: Time:081020 25 %B:305010010030 Flow Rate: 1.0mL/min Column Temp.:40C,#1044

21、6 #10447,GRACE,ELSD比UV更能准确反映样品实际的量,1:1 混合物,1. Ephedrine 麻黄素 2. Caffeine 咖啡因,10450,10449,Column: Alltima HP EPS C18, 5m, 150 x 4.6mm (Part No. 87715) Mobile Phase: 1% Acetic Acid:Methanol:Acetonitrile (70:20:10) Flow Rate: 1.0mL/min,GRACE,ELSD检测没有发光团的化合物不需要衍生,1. lauric Acid 2. Myristic Acid 3. Palmit

22、ic Acid 4. Stearic Acid 5. Arachidic Acid 6. Behenic Acid,9539,Column: Prevail Organic Acid, 5m, 150 x 4.6mm (Part No. 88640) Mobile Phase: (75:25) Acetonitrile:Methanol Flow Rate: 1.0mL/min,脂肪酸,GRACE,ELSD在分离使用的溶剂选择上有特点,1. LGG 2. LGL 3. LLL 4. OGL 5. PGL 6. OLL 7. OGO + PLL 8. OOO,10047,Column: Allt

23、ima C18, 5m, 250 x 4.6mm (Part No. 88056) Mobile Phase: A: Acetonitrile B: Dichloromethane Gradient: Time:040 %B:3050 Flow Rate: 1.0mL/min,Triglycerides in Evening Primose Oil 月见草油中的甘油三酯,GRACE,二氯甲烷对于高分子量的甘油三酯溶解度高.,荧光检测器的局限性,大多需要柱前或柱後衍生,无需衍生,荧光检测器的限制 ELSD的优点,GRACE,柱前衍生法分析氨基酸紫外 其它品牌的ELSD均为单一的强制分流模式;,前

24、面板的设计方便了喷雾头和漂移管的清洗 和维护,液体入口,废液出口,高灵敏度: 相当于2000ES的灵敏度, 高于其它品牌,Alltech Model 3300 ELSD,GRACE,基于Windows的LCD 方法向导一步步地输入分析条件后自动设定仪器参数 屏幕上显示谱图 出错和服务记录 包括中文在内的7种语言选择 直接连接Aglient 1200 ChemStation工作站无需A/D转换,Technical Status - Mechanical,Nebulizer: Modified to incorporate quick connect gas inlet and for easy

25、removal/installation without any tools Impactor: Mounted on a removable cartridge insert. By removing the nebulizer and the cartridge, the drift tube can be cleaned from the front through an access door.,Technical Overview Next Generation ELSD,Technical Status Mechanical (Cont.),Exhaust/Liquid Waste Line: Redesigned for a cleaner look. The condensed exhaust vapor is combined with the liquid waste through internal tubing. The exhaust vapor is vented to th