高效液相色谱法.ppt

1、1,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), HPLC与LC 高速：分析速度比经典液相色谱快数百倍 高效：颗粒细小、规则、均匀的固定相，分离效率高 高灵敏度：高灵敏度的检测器 高自动化,2,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), HPLC与GC 分离对象： GC: 气体和沸点较低的化合物 (有机物总量的20%) HPLC：高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的化合物(有机物总量的80%) 流动相： GC: 惰性气体，对组分没有亲和力，不产生相互作用，只起运载作用;

2、 HPLC：可选用不同极性的液体，对组分有一定的亲和力，参与固定相对组分作用的剧烈竞争 工作温度 GC: 高 HPLC：室温,3,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),4,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),5,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),6,Solvent Delivery System - pushes the solvent stream through the ins

3、trument at constant flow rate Autosampler - introduces the sample into the liquid stream of the instrument Column - a stainless steel tube packed with silicon beads that separates what Im looking for (the caffeine) from other compounds (like sugar) Detector - An optical sensor (usually) that detects

4、 changes in the characteristics of the solvent stream Data System - A means of controlling the system components and storing, processing and displaying data A high pressure pump is required to force the mobile phase through the column at typical flow rates of 0.1-2 ml/min. The sample to be separated

5、 is introduced into the mobile phase by injection device, manual or automatic, prior to the column.,7,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), HPLC INSTRUMENT 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统,8,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),9,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatogr

6、aphy, HPLC), 高压输液系统 溶剂贮存器 高压泵 梯度洗脱装置,10,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 溶剂贮存器：溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。 高压泵：将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程； 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。,11,高效液相色谱法(High Performance Liquid

7、 Chromatography, HPLC), 对泵的要求： 流量准确可调:流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min; 耐高压:泵的输出压力达到30-60MPa的高压; 液流稳定:输液泵输出的液 流应无脉动，或配套脉冲抑制器; 泵的死体积小:小于0.5mL； 耐腐蚀、密封性好,12, 高压输液泵：恒压泵、恒流泵 恒流泵：能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关； 恒压泵：保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromat

8、ography, HPLC),13,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),14,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),15,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),16,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 梯度洗脱装置 梯度洗脱：使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性

9、、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。 梯度洗脱装置分为两类： 外梯度装置（又称低压梯度） 内梯度装置（又称高压梯度）,17,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。,18,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),内梯度装置 （又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。,19,高效液相色谱

10、法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),：梯度洗脱的实质：是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱； ：它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。,20,Improvement in separation efficiency by gradient elution.,21,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatogr

11、aphy, HPLC), 进样系统 进样口 注射器 进样阀 它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离,22,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 进样阀,23,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),工作原理,24,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 注射器,25,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 分离

12、系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 6mm，柱长为10 50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。,26,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 检测器 检测器的要求：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。 溶质性检测器：它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等； 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。,27,高

13、效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 应用最广的检测器(80% 样品)； 试样必须有紫外吸收； 溶剂在检测波长吸收小； 类型 固定波长 (汞灯：254/280nm) 波长可调 (紫外可见分光光度计), 紫外检测器,28,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),29,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 光电二极管阵列紫外检测器： 计算机快速扫描采集数据，可得三维色谱,30,高效液相色谱法

14、(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),31,32,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 荧光检测器 具有荧光特性的样品(芳香基团的化合物)； 适用于：稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、蛋白质等； 灵敏度高：10-12 10-13g/mL，比紫外高2 3个数量级； 缺点：适用范围有一定局限性,33,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),34,高效液相色谱法(High Performance L

15、iquid Chromatography, HPLC), 电导检测器： 根据电导的变化来测定物质的含量 主要部件：电导池 受温度影响大，恒 温,35,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),36,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 电流检测器 对象：在一定电压下具有电氧化或者还原能力的物质,37,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),38,高效液相色谱法(High Performanc

16、e Liquid Chromatography, HPLC), 示差折光检测器：折射率随介质中的成分变化而变化,39,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),40,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), Choosing a Detector,41,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), 数据记录系统 记录仪 计算机 进行数据的采集、储存、显示、打印和数据处理等工作,42,高效液相色谱法(

17、High Performance Liquid Chromatography, HPLC),43,高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),The majority of the HPLC separations are done with Reversed Phase separation, probably over 90%. The rest is divided between the other modes described here.,44,液固吸附色谱法(Liquid-Solid Adsorption Chrom

18、atography, LSAC),45,液固吸附色谱法(Liquid-Solid Adsorption Chromatography, LSAC), 固定相固体吸附剂 吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，表层存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离 吸附能力的决定因素 主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质 试样的组成和结构以及洗脱液的性质等,46,液固吸附色谱法(Liquid-Solid Adsorption Chromatography, LSAC), 组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心

19、的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段； 不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。 吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。,47,液固吸附色谱法(Liquid-Solid Adsorption Chromatography, LSAC),固定相分类,非极性,极 性,活性炭,酸性吸附剂：硅胶和硅酸镁 适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺,碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁和聚酰胺 分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等,各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附

20、色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体,48,液固吸附色谱法(Liquid-Solid Adsorption Chromatography, LSAC), 流动相 流动相必须符合下列要求： 能溶解样品，但不能与样品发生反应； 与固定相不互溶，也不发生不可逆反应； 粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效； 应与所用检测器相匹配； 容易纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜。,49, 选择流动相的基本原则 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。 为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很广

21、则使用梯度洗脱。,液固吸附色谱法(Liquid-Solid Adsorption Chromatography, LSAC),50,液液分配色谱法(Liquid- Liquid Partion Chromatography, LLPC),51,液液分配色谱法(Liquid- Liquid Partion Chromatography, LLPC),一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。 分配平衡的总结果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数（K）或分配比（k）小的组分，保留值小，先流出柱。,52,液液

22、分配色谱法(Liquid- Liquid Partion Chromatography, LLPC), 固定相 分配色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类： 表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为30 40m的实心玻璃球和厚度约为1 2 m的多孔性外层所组成； 全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30 50 m的多孔型颗粒； 全多孔型微粒载体：由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为5 10 m。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。,53,液液分配色谱法(Liquid- Liquid Partion Chromatography, LL

23、PC),由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如， 氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鲨烷固定液等。,54,液液分配色谱法(Liquid- Liquid Partion Chromatography, LLPC), 流动相 选择原则：在分配色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端。如：当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。,55,液液分配色谱法(Liquid- Liqui

24、d Partion Chromatography, LLPC), 正相分配色谱： 以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的分配色谱，适合于分离极性化合物； 反相分配色谱：选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的分配色谱，适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物,56,液液分配色谱法(Liquid- Liquid Partion Chromatography, LLPC),In Reversed Phase separations organic molecules are separated based on their degree of hydrophobicity. There is

25、 a correlation between the degree of lipophylicity and retention in the column. This is the list of mobile phase parameters effecting retention and separation in Reversed Phase.,57,液液分配色谱法(Liquid- Liquid Partion Chromatography, LLPC),Elution order in Normal Phase HPLC shows that the polar solutes el

26、ute later than non-polar lypophilic ones.,58,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatography, CBPC), 化学键合相色谱：固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相； 避免了液体固定相流失的困扰 大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性,59,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatography, CBPC),根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。 在

27、极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱； 反相色谱系指非极性键合色谱，反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。,60,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatography, CBPC), 化学键合固定相的制备方法 化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。 硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相 将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C=）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。 硅氮型（=Si-N=）键合相 如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先

28、转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。,61,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatography, CBPC), 硅碳型（=Si-C=）键合相 将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。 硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相 将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。,62,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatogra

29、phy, CBPC), 反相键合相色谱法 在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称O D S或C18）硅胶-苯基等， 用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。 在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。,63,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatography, CBPC), 正相键合色谱法 在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。 流动相一般用比

30、键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。,64,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatography, CBPC), 离子性键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团如-SO3H , -CH2NH2 , -COOH , -CH2N(CH3)Cl等时，即形成离子性键合色谱。其分离原理与离子交换色谱一样。,65,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatography, CBPC),

31、化学键合色谱的优点： 适用于分离几乎所有类型的化合物：一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成和种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。,66,化学键合相色谱(Chemically Bond Partion Chromatography, CBPC), 由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。 键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。 固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。,67,离子

32、交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC),68,离子交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC),69,离子交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC), 分离机理 离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团； 当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。,70,离子交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC),Elution order

33、 in ion exchange chromatography is determined by the charge density (charge/radius) of the hydrated ion. In organic acids and bases the elution order is determined by their pKa or pKb (strength of acid or base).,71,离子交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC),Elution order in ion exchange chromatograph

34、y is determined by the charge density (charge/radius) of the hydrated ion.,72,离子交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC),In organic acids and bases the elution order is determined by their pKa or pKb (strength of acid or base).,73,离子交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC), 固定相 离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常

35、用的离子交换树脂分为三种形式： 常见的纯离子交换树脂； 玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂； 大孔径网络型树脂。,74,离子交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC), 按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。 阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂；强酸性阳离子交换树脂所带的基团为-SO3-H+ ，其中-SO3-和有机聚合物牢固结合形成固定部分，H+是可流动的能为其它阳离子所交换的离子阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。 阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。,75,离子交换色谱法(ion-e

36、xchange Chromatography, IEC), 流动相 离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液； 有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。,76,离子交换色谱法(ion-exchange Chromatography, IEC),77,尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography),78,尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography),When 2 components enter the column the big ones are exluded from the

37、gel pores and are carried in the flow through the interstitial volume only. The small ones penetrate the pores and stay longer in the column.,Larger Molecules elute first,79, 尺寸排阻色谱法动画模拟,尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography),80,尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography), 排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子

38、的尺寸进行分离的色谱技术。 排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质；凝胶的孔穴仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出入。,81,尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography), 对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔甚至于完全被排斥；小个的组分分子，大孔小孔都可以渗入，甚至进入很深，一时不易洗脱出来； 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗脱出来，它的洗脱体积很小，小的组分分子在色谱柱

39、中停留时间较长，洗脱体积较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，完成按分子大小而分离的洗脱过程。,82,尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography),尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。,83,尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography),84,亲和色谱法(Affinity Chromatography), 亲合色谱的原理,85,亲和色谱法(Affinity Chromatography), 亲合色谱的原理, Affinity Chromatography Method,86,色谱分离方法的选择, 要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其