基于核磁共振技术的代谢组学研究进展

基于核磁共振技术的代谢组学研究进展,1,生命科学领域的核磁共振技术代谢组学概述基于核磁共振的代谢组学研究进展,2,一、生命科学领域的核磁共振,3,磁共振成像(NMRI, Nuclear Magnetic Resonance Imaging),磁共振定域谱(MRS, Magnetic Resonance Spectroscopy),核磁共振波谱(NMR, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy),4,二、代谢组学概述,5,Jeremy K NicholsonImperial College London，UK,代谢组学的定义,Metabonomics: the quantitative measurement of the multi-parametric metabolic response of living systems to pathophysiological stimuli or genetic modifications对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定。,J. K. Nicholson, J. C. Lindon, E. Holmes. Xenobiotica, 1999, 29: 1181-89.,技术：NMR动物代谢分析：动物的体液和组织,6,Oliver FiehnUniversity of CaliforniaHealth Sciences DriveDavis, USA,Metabolomics: comprehensive analysis of all the metabolites of an organism. The quantitative measurement of all low molecular weight metabolites in an organisms cells at a specific time under specific environmental conditions.生物体所有代谢物的系统分析。本质是“给定细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物的定量分析”。,O. Fiehn. Plant Mol. Biol., 2002, 48: 155171.,技术：GC-MS植物代谢分析：细胞,7,代谢组学的发展,Horming, et al.: Metabolic profiles of metabolites in human,8,代谢组学的中心任务,对生物体液和组织中内源性代谢物质进行系统测量和分析。对生物体在受到病理生理上的刺激以及某种基因修饰所带来的代谢物的动态变化进行量化和编录，从而得到生物体代谢随时间及生化过程的变化而改变的信息。将这些信息与病生理过程中的生物学事件关联起来，从而确定此变化规律相关的靶器官和作用部位，进而确定相关的生物标志物。,9,系统生物学(Systems Biology)的组成,10,不同组学关系及分析技术,11,Metabolomics is More Time Sensitive Than Other “Omics”,Metabolomics,Proteomics,Genomics,Response,Response,Response,Time,12,各种组学技术的比较,13,代谢组学分析检测技术,UPLC, HPLCCE/microfluidicsLC-MSFT-MSQqQ-MSNMR spectroscopyX-ray crystallographyGC-MSLIF detection,14, 简便：样品不需复杂预处理，检测不需严格分析条件，避免引入干扰物的可能。 快捷：常规1H NMR谱只需几分钟，且对低分子量和高分子量的代谢物均能给出定性和半定量的信息。 避免漏检：不需预先选定化合物，在对待测物知识非常有限的情况下意义尤为重要。,基于NMR的代谢组学的特点,15, 不破坏样品的原有组成：NMR方法具有无损伤性, 可以在生理条件下对样品进行实时检测且不影响混合物的生理生化性质甚至化学平衡，以达到模拟体内条件和进行分子水平的分析需要。 NMR方法可以进行实时和动态的检测。,基于NMR的代谢组学的特点,16, 分析组织的高分辨魔角旋转(HR-MAS) NMR方法：消除了磁场不均匀性、化学位移各向异性和偶极偶极相互作用带来的谱线增宽影响，从而可以获得与液体高分辨NMR 相媲美的分辨率。 无偏向性: NMR对所有化合物的灵敏度是一样的, 氢谱中谱峰和化合物的氢原子是一一对应的, 所测的每个氢原子都有其相关的谱峰, 并且信号的强弱反映样品中各组分的相对含量。,基于NMR的代谢组学的特点,17, 多参数：从核磁谱图中的多种参数得出结构信息。对于药物代谢来说，可以通过化学位移、谱峰的多重性、偶合常数、弛豫时间、NOE 效应、谱峰强度等多种参数对同一问题做全面的反映。 多核与多维NMR：解决同一问题可采用多核（1H、13C、15N、31P、23Na、7Li、139La 等）和多维（2D COSY、NOESY、TOCSY、HSQC）等多种核磁共振编辑手段和实验方法。,基于NMR的代谢组学的特点,18, 检测灵敏度低：500MHz谱仪的1H NMR的检测限理论为10M。 水峰过强：体液中的生物分子一般其浓度为毫摩尔级，水中质子浓度约为100 mol/L，是生物分子浓度的105 倍! 检测动态范围有限：很难同时检测同一样品中含量相差很大的物质。 谱峰重叠及谱线较宽。,NMR检测生物样品中存在的问题,19,代谢组学中主流技术的比较,20,Analytical Approaches,Bio-systems,Exogenous,Endogenous,Exposure assessmentBio-monitoringDisease diagnostics,Time courseDose response,Toxins, DrugsEnvironmentaletc,Metabolic pathways,Databases,Mol. Biosyst. 2009, 5: 288; J. Proteome. Res. 2009, 8: 5657; 2009, 8: 352.,代谢组学方法和流程,21,三、基于NMR的代谢组学研究进展,22,在药物毒理代谢组学的研究领域，最为瞩目的工作是国际COMET (Consortium for Metabonomic Toxicology)计划，旨在建立代谢组数据库，并为目标器官及其位点的毒性建立预测性专家系统。他们已经建立起了第一个基于机器学习的实验室啮齿动物肝脏和肾脏毒性预测的专家系统。,1. 毒理研究,23,肾毒素：HgCl2、CdCl2、Na2CrO4、硝酸铀酰、苯酚、对氨基苯酚、六氯丁二烯(HCBD)、顺铂、2-溴乙胺(BEA)、丙烯亚胺(PI)等 肝毒素：肼、异硫氢酸萘(ANIT)、半乳糖胺(GaIN)、羟丁基甲苯(BHT),24,例1.各种肾毒素对大鼠尿液1H NMR 谱的影响。A, 对照组；B，20 mg/kg Na2CrO4(肾脏近曲小管毒)组；C，50 mg/kg 对氨基苯酚(肾脏近直小管毒)组；D，50 mg/kg 丙烯亚胺(令肾髓质坏死)组；E，250 mg/kg 2-溴乙胺(产生急性肾乳头坏死)组。,25,-25,-20,-15,-10,-5,0,5,10,15,20,25,-30,-20,-10,0,10,PC1,PC2,PAP,ANIT,Control,-15,-10,-5,0,5,10,15,-40,-30,-20,-10,0,10,PC1,PC2,ANIT,Control,a-naphthylisothiocyanite (ANIT),p-Aminophenol (PAP),Control,26,尿中乳酸升高：急性肾小管受损TMAO、DMA、DMG和琥珀酸水平升高：肾乳头受损氨基酸，乳酸（血中）升高：急性肝受损氨基酸，乳酸（尿中）升高：肾小管损坏尿中琥珀酸升高，-酮戊二酸升高，柠檬酸降低：肾小管酸中毒或线粒体酶活性降低牛磺酸升高：肝脏受损酮体含量升高：线粒体中酶代谢紊乱肌酸含量升高：睾丸毒,一些重要的NMR markers,27,基于NMR 的代谢组学方法不仅能区分组织器官的正常与非正常的状态，而且能给出毒性作用的靶器官以及作用机制，识别出毒性的生物标记物。,28,2. 药物代谢及 安全性评价,药物种类：利尿剂（乙酰唑胺），抗菌素（氨比西林、苄基青霉素、先锋霉素、氟氯西林、青霉素），中枢神经药（脱氧麻黄碱），抗炎解热镇痛药（氨茴酸、萘普生、布洛芬、阿斯匹林、退热净、扑热息痛），抗滴虫药（灭滴灵），治关节炎药（青霉胺），抗癌药物（ Au(Ph2P(CH2)2PPh2)2Cl 、IF、 Carboplation Pt(II)(NH3)2 ）样本：鼠尿，鼠胆汁，人尿，人淋巴液，血浆方法：1H NMR, 13C, 19F NMR, 31P, 1H-1H COSY, 1H-19F COSY,29, 在药物开发阶段，代谢组学不仅可以进行早期活体毒理测试，而且能为药物分子的筛选提供依据； 在药物临床应用前，它能帮助确定药物的安全性生物标记物和代谢表型； 评价将动物模型实验应用于人类疾病的可行性。,30,3. 病理诊断及病理生理学,代谢组学相对于基因组学研究来说，在疾病（如癌症，糖尿病，心血管疾病，肥胖，哮喘）领域是一个相对较新，不断获得更加广泛认可的分析方法。利用代谢组学的方法可以实现对疾病的诊断，通过对生物标记物的寻找和相关代谢网络的研究，探寻生物标记物的代谢途径和疾病的产生机理，实现对疾病的诊断。,31,1957年， “NMR医学研究系”1979年，利用体液的氢谱对癌症进行诊断 1986年，利用人血浆中脂蛋白峰的甲基和亚甲基的线宽区别进行恶性肿瘤的诊断近年来，通过对血浆、血清、脑脊液、卵巢囊液、组织液、鼠肝提取液的NMR分析，对体液NMR技术进行癌症或一些特异的肿瘤如：子房瘤、卵巢瘤、脑瘤、肝脏淋巴瘤、中枢神经系统恶性胶质瘤进行检测诊断的可能性进行了研究。,32,临床和生化研究的一个重要领域：利用高分辨NMR技术研究慢性肾功能衰竭(chronic renal failure, CRF)者的生化异常。利用NMR技术可以研究先天性代谢失常，包括2-羟基戊二酸尿症、棕色糖尿病、酪氨酸血症、先天性血色沉着病、先天性尿道钙结石，在其它疾病如脑白质病、糖尿病、神经病等方面也取得了一些有益的研究成果。,33,例1. Urine samples Cataract（白内障）,Cataract (48),Control (48),34,例2. Serum samples-cardiovascular disease (冠心病),Brindle JT et al., 2002. Nat Med. 8(12), 1439-45.,35,4. 食品安全及质量控制,目前对饮食的安全可靠性和食品的质量控制引起了科学领域和公众的特别关注，促进了在食品领域的代谢组学分析和对其质量控制方面的研究。,36,目前主要研究方向：酒精饮料和酿造食品（啤酒、葡萄酒、蒸馏酒、酱油、醋），咖啡和茶类，水果和蔬菜（果汁、柑橘、猕猴桃、芒果、黑树莓、甜瓜、西瓜、西红柿、莴苣、芸苔、土豆、胡萝卜、玉米、小麦），橄榄油，牛奶和乳制品（牛奶、奶酪、黄油和人造黄油），蜂蜜，鱼和肉类。还有其它的研究如松露、菌类和藏红花。,37,PCA (A) and OPLS-DA (B) 3D score plots derived from the 1H NMR spectra of beef sirloin (or chuck) extracts obtained from Australia, Korea, New Zealand, and the United States of America.,例1. Extracts from beef sirloin (牛里脊肉),38,例2. Beer（啤酒）,The same company, protocol (Genome), pipe-line (Proteome), but different taste (Metabolome),39,例3. Wine（葡萄酒）,Red wineMore tannins and phenolics,White wineMore amino acid,40,例4. 蜂蜜（Honey）,CJ (Chinese jujube，枣花), LJ (Lonicera japonica，金银花), FS (Flos sophorae，槐花), FCI (Flos chrysanthemi indici，菊花), EJ (Eriobotrya japonica，枇杷),不同花蜜的NMR谱,41,例4. 蜂蜜（Honey）,相同产地不同花源,相同花源不同产地,相同厂家不同批次,42,5. 营养代谢研究 代谢组学的方法可以帮助识别和常量营养物的最终摄入效应密切相关的代谢物，并且有助于定义各种常量营养物的正常摄入范围。营养代谢组学（Nutrimetabolomics）定义的提出。,43,饮食与营养科学与代谢组学相结合系统地表征在不同健康状态（健康，亚健康，疾病）下，饮食习惯，地域差异，营养结构（种类和用量），营养相关疾病等对机体造成的细微代谢变化，这些变化概况为探索不同饮食或营养条件下机体内的细胞，组织和器官的生物标记物，代谢整体水平以及代谢作用机制，并有可能为机体的健康状况动态地况进行诊断和营养搭配提供新的策略。,44,6. 功能基因组的研究 随着人类基因组测序工作的完成，人们已经步入到了后基因组时代即对功能基因组学的研究。通常，功能基因组学利用基因组提供的信息和产物，运用遗传或其他新的实验技术，通过识别基因在一个或多个生物模型中的作用来全面认识和分析基因的功能。,45,基因产生变异的生物体在生长速率等表型上可能没有显著的改变，这是因为细胞内的代谢物浓度的改变补偿了变异产生的影响。但是这也同时意味着生物体在代谢表型上可能会有显著的变化。代谢组学作为功能基因组学研究应用的一个重要方法，主要是从基因表达谱的终点代谢物组的信息来鉴定或推测出基因的功能。“基因组学告诉我们什么可能发生，代谢组学则告诉我们发生了什么”，二者相互关联，将会从现象到本质探寻生命的奥秘。,46,7. 中医药现代化 代谢组学有可能在中医“病、证、方”的研究体系中发挥作用，在规范中医基于证的诊断标准、探索证候的动态内涵和演变规律，以及提示证与疾病疗效的相关性和科学性方面扮演重要的角色。另外在中药质量控制、整体疗效和中药安全性也进行了初步研究。,47,8. 微生物领域的研究 微生物代谢组学是力求在特定的条件下分析微生物体系中所有代谢物的动态变化，它不仅反映了基因、转录和环境等作用的最终结果，还为发现新的标记代谢物和代谢网络中复杂的相互作用提供信息。在微生物分类，突变体筛选、发酵工艺的监控和优化、微生物降解环境污染物以及人体健康（如口腔、肠道）等方面有着重要的应用。,48,9. 环境科学 环境代谢组学是研究生物有机体与生态环境相互作用，探讨生物体应对生态环境影响作用的代谢概况的一门学科。