杨树连载对土壤微生物特性的影响-土壤学

摘 要摘 要以下辽河平原农田和不同退耕年限杨树林为研究对象（一代 10 年生林、二代 6 年生林、二代 15 年生林），分析了杨树连栽对土壤肥力及微生物数量、结构组成和生物多样性的影响。杨树连栽改变了土壤的物理化学性质和生物特性：农田退耕后，土壤pH 升高，微生物量碳、氮和几乎所有养分指标（速效钾除外）均呈现下降趋势，随着退耕年限的延长，土壤全碳、全钾、铵态氮、速效钾和微生物量均有上升趋势；土壤基础呼吸和过氧化氢酶活性均表现为农田低于林地，而林地之间并无显著改变；而脲酶和中性磷酸酶活性表现为农田最高，二代 6年生林最低。相关性分析结果显示：微生物量碳、氮和脲酶活性与大部分养分指标均呈显著或极显著正相关，说明微生物量和脲酶可以作为评价土壤肥力的有效指标。采用荧光定量 PCR 技术测定杨树连栽对土壤细菌、真菌和氮素转化相关功能菌群数量的影响，结果表明：退耕还林后土壤细菌、真菌、氨氧化细菌和反硝化细菌数量均下降，而氨氧化古菌数量升高，固氮细菌变化不显著；林地之间，细菌和反硝化细菌数量随着退耕年限的延长逐渐增多，而真菌表现为二代 6 年生林最低，氨氧化细菌、古菌和固氮细菌均为二代 6 年生林最高。相关性分析结果显示：细菌、氨氧化细菌和反硝化细菌与大多数养分指标均呈显著或极显著正相关，表明细菌、氨氧化细菌和反硝化细菌亦受土壤养分状况的影响；氨氧化古菌与硝化潜势呈极显著正相关，说明本研究地区氨氧化古菌在氨氧化过程中起着主要作用。采用 PCR-DGGE 技术测定杨树连栽对土壤微生物群落多样性的影响，结果表明：退耕还林措施明显改变了土壤真菌、氨氧化古菌和固氮细菌群落结构，明显提高了真菌和氨氧化古菌群落丰富度和多样性。随着杨树连栽年限的延长，真菌和固氮细菌群落结构发生了显著改变，但其丰富度和多样性变化并不明显；而氨氧化古菌群落结构和多样性均无明显改变，说明植被类型可能是影响氨氧化古菌群落结构的主要因素。关键词：杨树连栽，微生物量，微生物数量，氨氧化古菌，固氮细菌Impacts of continuous cropping poplar on soil microbial propertiesAbstractIn Jixie Forest Farm in Xinmin City, Liaoning of Northeast China, we investigated the effect of the land use changes (farmland, the first rotation of ten-year-old, the second rotation of six-year-old, and the second rotation of fifteen-year-old) on the soil fertility and soil microbial communities.Planting poplar altered soil nutrient contents, microbial biomass, and enzyme activities: Reforesting decreased most of the soil nutrient contents and microbial biomass; while with the increasing stand age, the soil total C, total K, NH4+N, available K and microbial biomass presented an increasing trend. The soil basal respiration and catalase activity were significantly higher in poplar stands than in farmland, whereas the soil urease and neutral phosphatase activities showed an opposite trend. There was no significant change for the catalase activity in the three poplar stands, while both of the urease and neutral phosphatase activities was lower in the second rotation of six-year-old poplar plantation than the other two poplar stands. Correlation analysis showed that the soil microbial biomass and urease activity were positively correlated with the majority of the soil nutrient, indicating that the soil microbial biomass and urease activity can be used to reflect the changes of soil quality.The effect of planting poplar on the abundance of bacteria, fungi, ammonia-oxidizing bacteria and archaea (AOB and AOA), denitrifying bacteria and nitrogen-fixing bacteria was studied by Real-time PCR. The results showed that: After returning farmland to forestland, the abundance of bacteria, fungi, AOB and denitrifying bacteria decreased, while AOA exhibited an opposite trend, and there was no significant change for nitrogen-fixing bacteria. With the increasing stand age and successive rotation duration, the abundance of bacteria and denitrifying bacteria presented an increasing trend. The quantities of AOB, AOA and nitrogen-摘 要fixing bacteria in the second rotation of six-year-old poplar higher than the other two poplar stands, while the fungi were lower. Correlation analysis showed that the quantities of bacteria, AOB and denitrifying bacteria were positively correlated with the majority of soil nutrient, indicating that the quantities of bacteria, AOB and denitrifying bacteria can be sensitive to reflect the changes of soil quality. The potential nitrification rate appeared to be in significantly positive correlation with the abundance of AOA, but not with that of AOB. The finding demonstrated that the effects of AOA on nitrification are more pronounced than AOB. Results of PCR-DGGE profiles showed that: After returning farmland to forestland, the community structures of fungi, AOA and nitrogen-fixing bacteria obviously changed, and higher richness and diversity index for fungi and AOA were also observed. With the increasing stand age and successive rotation duration, only the community structure of fungi and nitrogen-fixing bacteria have a significant changed, but not for the community of AOA, which indicated that vegetations types may be the decisive factor for ammonia-oxidizing archaea.Key words: continuous cropping poplar; microbial biomass; Ammonia-oxidizing archaea; Ammonia-oxidizing bacteria; Nitrogen-fixing bacteria目 录目 录致 谢 .i摘 要 .IAbstract .II第一章 引言 .11.1 人工林地力衰退研究进展 .21.1.1 人工林连栽对土壤养分状况的影响 .31.1.2 人工林连栽对土壤酶活性的影响 .41.1.3 人工林连栽对土壤微生物量和基础呼吸的影响 .41.1.4 人工林连栽对土壤微生物群落的影响 .51.2 土壤微生物研究方法 .51.2.1 传统研究方法 .61.2.2 BIOLOG 微平板分析法 .61.2.3 磷脂脂肪酸（PLFA）分析法 .71.2.4 分子生物学研究方法 .81.2.4.1 以 PCR 为基础的研究方法 .81.2.4.2 高通量测序技术 .111.2.4.3 荧光原位杂交技术(FISH) .121.3 影响土壤微生物特性的主要因素 .121.3.1 植被 .131.3.2 土壤类型 .131.3.3 温度和水分 .141.3.4 土地的利用和管理方式 .14第二章 试验设计和样品采集 .172.1 研究目的及技术路线 .172.2 研究地区概况 .182.3 试验设计 .192.4 样品采集 .19第三章 杨树连栽对土壤肥力的影响 .203.1 供试材料 .213.2 试剂 .213.3 仪器设备 .213.4 样品测定 .223.4.1 氯仿熏蒸处理 .223.4.2 K2SO4 浸提 .223.4.3 测定分析 .233.5 数据处理 .233.6 结果与讨论 .243.6.1 杨树连栽对土壤理化指标的影响 .243.6.2 杨树连栽对土壤微生物量和基础呼吸的影响 .263.6.3 杨树连栽对土壤酶活性的影响 .273.6.4 土壤理化指标和生物指标相关性分析 .293.7 小结 .29第四章 杨树连栽对土壤微生物数量的影响 .314.1 供试材料 .324.2 实验方法 .324.2.1 主要仪器设备 .324.2.2 主要试剂盒 .324.2.3 实验方法及步骤 .324.2.3.1 DNA 提取方法 .324.2.3.2 土壤 DNA 的 Real-time PCR 扩增 .334.3 数据处理 .364.4 结果与讨论 .364.4.1 杨树连栽对土壤细菌和真菌数量的影响 .364.4.2 杨树连栽对土壤氨氧化细菌（AOB ）和氨氧化古菌（ AOA）数量的影响.374.4.3 杨树连栽对土壤固氮细菌和反硝化细菌数量的影响 .394.4.4 土壤微生物数量与土壤肥力指标相关性分析 .40目 录第五章 杨树连栽对土壤微生物菌群多样性的影响 .435.1 供试材料 .435.2 实验方法 .435.2.1 DNA 的提取 .435.2.2 土壤 DNA 的 PCR 扩增 .435.2.2.1 试剂 .435.2.2.2 仪器设备 .445.2.2.3 扩增条件 .445.2.3 PCR 产物的 DGGE 图谱分析 .455.2.3.1 试剂 .455.2.3.2 仪器设备 .455.2.3.3 DGGE 分析 .465.3 数据处理 .465.4 结果与讨论 .475.4.1 杨树连栽对土壤真菌多样性的影响 .475.4.2 杨树连栽对土壤氨氧化古菌多样性的影响 .505.4.3 杨树连栽对土壤固氮细菌多样性的影响 .54第六章 结论 .57参考文献 .59文章发表情况 .73第一章 引言第一章 引言随着经济的发展，人类对木材的需要量越来越大，已有的天然林资源已不能满足人们日益增长的物质需要。因此，要求不断发展人工林资源来补偿天然林资源的不足，从而达到缓解木材供需的矛盾，速生丰产人工林己成为当今世界林业发展的一种趋势。杨树（Poplus spp.）是世界中纬度平原地区栽培面积最大，木材产量最高的速生树种之一，不仅具有生长快、成材早、产量高、易于更新的特点，而且具有广泛的工业用途，因此，国内外都非常重视杨树人工林培育和杨树产业化的发展。而杨树产业的发展，可以有效缓解我国用材供应的紧张状况，改善我国森林资源结构，优化农村产业结构，促进广大农民增收和地方经济发展，并且杨树具有涵养水源、保育土壤、固碳供氧、净化环境、维持生物多样性等巨大生态系统服务价值。然而，同我国其它主要造林树种（杉木、落叶松和按树等）一样，杨树人工林由于采取短轮伐期和连作等经营措施，导致土壤质量不断衰退，生产力不断下降，给林业生产持续发展造成威胁（许幕农，1992；孙翠玲等，1995） 。因此，为了实现短轮伐期杨树人工林能够持续快速丰产，林地土壤肥力得到提高和保持，也为了我国的土地资源和环境保护，开展连栽杨树人工林的系统研究是很有必要的。土壤是一个充满生机的生态系统，土壤微生物是土壤生态系统中极其重要和最为活跃的部分，是土壤中一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称，通常意义上应当包括古菌、细菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类等（林先贵等，2008），在土壤养分转化循环、系统稳定性和抗干扰能力以及土壤可持续生产力中占据主导地位，控制着土壤生态系统功能的关键过程。随着对微生物在土壤中重要功能认识的不断深入，用土壤微生物参数来评价土壤的健康和质量愈来愈受到人们的关注。这些参数包括土壤微生物量、活性、土壤各种酶活性以及群落结构多样性等（黎宁等 2006）。土壤微生物量既是土壤养分的储存库，也是作物生长养分的重要来源(Spedding et al., 2004)，能综合反映微生物活性强度和有机质分解过程，能代表参与调控土壤中能量和养分循环以及有机物质转化的微生物数量。而土壤微生物数量和分布，不仅是土壤中有机养分、无机养分及土壤通气透水性能的反应，亦是土壤中生物活性的具体体现（杨玉盛等，1999），是土壤肥沃程度的一个重要指标（杜国坚等，1995）。土壤是微生物的大本营，是微生物生长和繁殖的天然培养基，土壤微生物资源在自然界中最为丰富多样。所谓土壤微生物多样性，即指土壤生态系统中所有的微生物种类、它们拥有的基因以及这些微生物与环境之间