肝癌靶向性果胶基纳米给药体系的初步研究-药剂学

1中文摘要目的：制备果胶基载 5-氟脲嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）纳米粒子（5-FU-NPs ）载药系统，探讨果胶基纳米载药体系本身带有的大量的半乳糖残基这种天然靶头对人肝癌细胞 HepG2 的靶向效果，及在大鼠体内的药代动力学的研究。方法：对本实验室设计合成的果胶基纳米载药系统，进行体内、外抗肿瘤及肿瘤靶向性的评价：1. 体外抗肿瘤及肿瘤靶向研究：采用 MTT 法观察 5-FU 及 5-FU-NPs 对去唾液酸糖蛋白受体表达量不同的 HepG2、A549 细胞的增殖抑制作用，并计算其 IC50 值；采用 HPLC 法测定 HepG2、A549 细胞对 5-FU 及 5-FU-NPs 的摄取情况，用半乳糖分别与 HepG2、A549 细胞孵育 2 h 后再测两种细胞对 5-FU 及 5-FU-NPs 的摄取情况。2. 体内药代动力学的研究：采用尾静脉注射给药的方法，用 HPLC 测定血药浓度，得出 5-FU 及 5-FU-NPs 的血药浓度- 时间曲线，用 3P97 计算 5-FU 及 5-FU-NPs 的药动学参数。结果：MTT 结果表明 5-FU-NPs 对 HepG2 细胞的增殖具有明显抑制作用,且呈剂量依赖性,作用较 5-FU 明显增强( p0.05)；而 5-FU-NPS 和 5-FU 对 A549 细胞增殖抑制作用,未见明显差别( p0.05)。不同浓度的空白纳米粒子均未对两种癌细胞产生抑制作用, 最高浓度空白纳米粒对 HepG2 和 A549 细胞平均抑制率分别为 4.07%和 10.07%，说明了我们制备的果胶基纳米粒子具有很好的生物相容性。HPLC 结果表明： HepG2 对 5-FU-NPs 的摄取量是 5-FU 的 2.36 倍, 有显著差别( p0.05) 。而 A549 细胞对 5-FU-NPs 和 5-FU 摄取没有明显的差别（ p0.05） ，当 HepG2 和 A549 细胞被半乳糖孵育两个小时后，5-FU-NPs 与 HepG2 细胞的结合量是没有被半乳糖饱和的 HepG2 细胞的 0.5 倍，有显著差别（ p0.05） ；而 5-FU 与 HepG2 细胞的结合量是没有被半乳糖饱和的 HepG2 细胞的 0.9 倍；没有显著差别（ p0.05） ；5-FU-NPs 与 A549 细胞的结合量是没有被半乳糖饱和的 A549 细胞的 0.96 倍, 没有显著差别（ p0.05） ，而 5-FU与 A549 细胞的结合量是没有被半乳糖饱和的 A549 细胞的 0.85 倍，也没有显著差别（ p0.05） 。体内药动学结果表明：5-FU-NPs 能有效延长 5-FU 在大鼠2体内的生物半衰期，并且 5-FU-NPs 在血浆中的峰浓度是 38.1197g/mL, 而游离5-FU 的峰浓度为 48.5276g/mL，可减小药物的毒副作用。结论：1. 果胶基纳米载药体系无毒, 生物性溶性好；2. 果胶基纳米载药体系在体外具有明显的抗肝癌效果且对肝癌细胞有一定的靶向作用； 3.果胶基纳米载药体系可延长化疗药物 5-FU 在 SD 大鼠体内的生物半衰期。关键词：果胶基纳米粒子；ASGPR ；肝癌靶向给药体系；药代动力学； 5-FU3英文摘要Preliminary Study on Hepatocellular Carcinoma Targeting Pectin-based Nanoparticle Delivery SystemAbstractObjective: In this study, we report a fabrication of natural pectin-based drug delivery system, and further report the evaluation of in vitro cytotoxicity, cellular uptake and in vivo pharmacokinetic of the 5-FU-loaded nanoparticles.Method: In vitro: Inhibited effects of 5-fluorouracil (5-FU) and 5-FU-loaded nanoparticles (5-FU-NPs) on proliferations of HepG2, A549 tumor cells was observed by MTT assay and IC50 value was calculated; absorption of 5-FU and 5-FU-NPs by HepG2, A549 tumor cells in the 120th minute was detected with High Performance Liquid Chromatography(HPLC); targeting effect of 5-FU and 5-FU-NPs on HepG2 tumor cells was detected by evaluate the absorption of 5-FU and 5-FU-NPs by HepG2 and A549 tumor cells in the120th minute while the HepG2 and A549 tumor cells was fist incubated with galactose.in vivo: Pharmacokinetics study using Sprague Dawley (SD) rats. Mice were treated by tail vein i.v. injection with 5-FU or 5-FU-NPs at a matched dose of 35 mg/kg, the blood concentration was detected by HPLC, and the pharmacokinetic parameters were obtained by running software 3p97.Result: 5-FU-NPs can significantly inhibit the proliferation of HepG2 and A549 cells in a dose-dependent way, and it is more effective than free 5-FU (P0.05). 5-FU-NPs can also inhibit the proliferation of A549 cells in a dose-dependent way, but there is no significant difference compared with 5-FU (P0.05). Results of HPLC show that the absorption of 5-FU-NPs in HepG2 tumor cells is 2.36 times of free 5-FU but in A549 tumor cells there is no significant difference (P0.05). When incubated with glactose the absorption of 5-FU-NPs in HepG2 tumor cells is half of without glactose but approximately the same with free 5-FU (P0.05); the absorption of 5-FU-NPs in 4A549 tumor cells is closely to that of without glactose (P0.05) . The pharmacokinetic result indicate that the 5-FU-NPs effective duration is much longer than that of free 5-FU, and the peak concentration of 5-FU-NPs is much lower than free 5-FU.Conclusion: 1. The pectin-based nanoparticles has the excellent biocompatibility, nontoxicity , characteristics;2. The pectin-based nanoparticles have the targeting effect for hepatocellular carcinoma cells;3. The pectin-based nanoparticles can prolong the biological half-life of 5-FU. Yanmei Wang（Pharmacology ）Directed by Fengxiang Yan and Cuiyun YuInstitute of Pharmacy and PharmacologyUniversity of South China, Hengyang (Hunan Province) 421001, ChinaKey words: pectin nanoparticles; ASGPR; HCC targeted drug delivery; pharmacokinetic; 5-FU5第一章 绪论目前，癌症是人类第一大杀手，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC，以下简称肝癌）是世界上第五大常见肿瘤，据统计，每年约有超过 6 万人死于肝癌及 50 万的新发病例 1。大约 85% HCC 病例发生在欠发达地区，中国就占了其中的 50% 之多 2 。肝癌的治疗目前主要有手术切除、放射治疗、化学药物治疗、介入治疗等 3,4。大约 50以上的患者会在疾病的早期阶段进行手术切除，但即使是根治性切除术后， 仍有 80的患者两年内会在残余的肝组织长出新的肿瘤并最终死于渐进性疾病 2。再加上肝癌起病隐袭，早期诊断困难，临床上绝大部分 HCC 患者就诊时多属中晚期，缺少手术指征，失去了手术治疗的最佳时期 5。故大多数肝癌患者只能接受非手术治疗 6，比如选择化学药物治疗等。5-氟脲嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）作为目前最广泛应用的细胞毒抗肿瘤药物之一，对结肠癌、乳腺癌、胃肠道癌、肝癌等癌症显示良好的治疗效果。它的作用机制为在细胞内转化为 5-F-dUMP 而抑制脱氧核普酸合成酶，阻止dUMP 甲基化为 dTMP，从而影响 DNA 的合成；另外，5-Fu 在体内转化为 5-氟尿嘧啶核苷(5-FUR)后，掺入 RNA 中干扰蛋白质合成 7。同时也伴随着很强的毒副作用如骨髓抑制、胃肠道反应、白细胞减少症、血小板减少等，这可能是由于血药浓度太高和抗癌药物的非特异性的全身分布引起的 8，这一点严重限制了其临床应用。此外，口服给药后药物在胃肠道中的吸收是非均匀的，这是药物被二氢嘧啶脱氢酶或尿嘧啶还原酶代谢所致 9。因此，为了避免这些缺点，药物传递系统如：纳米粒子，脂质体，微乳剂等应运而生 10-13。靶向给药( Targeted drug delivery, TDD)是指药物通过局部或全身血液循环而浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞的给药方式，分为主动靶向和被动靶向两种方式 14。纳米粒子，脂质体和胶束可以通过肿瘤 EPR（Enhanced Permeability and Retention）效应被动靶向于肿瘤组织，同时也可通过对纳米载体上接枝配体，利用肿瘤细胞中某些酶和受体的高水平表达实现主动靶向 14-16。纳米靶向给药系统能将抗肝癌药物选择性地运送到肝肿瘤部位，增加肿瘤部位6的药物浓度，而且缓慢释放药物，从而使药物浓度可以较长时间地维持在有效浓度，达到持久有效的抗肝癌效果 17。同时减少药物对正常肝组织和其它脏器的细胞毒性，降低药物的毒副作用 17。聚合物纳米粒子（nanoparticle, NP）具有缓释、保护药物、提高疗效以及降低毒副作用等优点，并还具有良好的生物相溶性、稳定的理化性质和网状内皮系统靶向性等独特的优势和潜在的应用价值，对各种肿瘤疾病的治疗具有特殊意义 18,19。 尤其是网状内皮细胞丰富的肝癌或原发于其他部位恶性肿瘤的肝转移。在经静脉给药入血后，聚合物纳米载药粒子会与血浆蛋白或糖蛋白等多种成分相结合，被肝脏中数目众多且位置固定的网状内皮细胞（即 Kupffer 细胞）识别，进而作为异物被单核巨噬（mononuclear phagocyte system, MPS）系统吞噬，从而聚集在肝脏，使被包载的药物在肝脏内聚集，使肝脏药物浓度增加，从而减轻对其它脏器的毒副反应 19。与正常组织相比，大多数实体瘤的病理生理特征显著不同：肿瘤血管生长迅速，外膜细胞缺乏，基底膜变形，淋巴管道回流系统缺损，大量血管渗透性调节剂的生成，导致肿瘤血管对大分子物质的渗透性增加，并由于肿瘤组织的淋巴管道回流系统缺损而高浓度、长时间蓄积在肿瘤组织中，进而产生增强穿透性和延长保留时间的效应，即为增强的渗透保留效应（Enhanced permeability and retention effect，EPR ） 20,21。因此，大分子药物和药物载体如聚合物纳米粒子、胶束、脂质体等可以穿透肿瘤缺损的血管内皮细胞进入肿瘤组织，并在肿瘤组织堆积。这使得聚合物纳米粒子具有被动靶向性。主动靶向制剂就是用修饰了靶头的药物载体材料将药物定向的送到靶区浓集发挥药效。受体介导系统（receptor-mediated endoeytosis systems，RMEsystems ）是指针对肝细胞膜上的不同受体，对药物或载体进行修饰，利用配体与肝细胞受体的高特异性，高选择性和高亲和性，将药物导向到肝细胞内发挥药理作用的给药系统 22。去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR ）是一种跨膜蛋白，主要存在于哺乳动物肝实质细胞表面能专一识别分子末端带有半乳糖残基的糖蛋白，并与之结合，定向转运到肝细胞内的溶酶体进行代谢 23。每个肝细胞包含大约 200 万 ASGPR的结合位点 24。后来有研究报道，一些肿瘤细胞如 Caco-2、HT-29 25结肠癌细7胞及 HepG2 肝癌细胞 26等表面也有去唾液酸糖蛋白受体表达。以半乳糖残基或乙胺基半乳糖残基的糖链作为药物载体，能选择性吞噬异源性复合物的特性，可将药物特异性导入肝细胞治疗乙型肝炎和高血脂等疾病，或直接运送至肝癌细胞的溶酶体并释放药物治疗原发性肝癌 22 。因此，研究人员开始研究以去唾液酸糖蛋白受体为靶点的药物传递系统，希望带有半乳糖残基的药物传递体系可以通过血液循环将抗肿瘤药物运送到肿瘤组织，从而增加抗癌药物的局部浓度 27, 28。生物可降解聚合物（Biodegradable Polymers）系指在生物体内能被降解或酶解，生成的小分子物质被机体吸收并排出体外的一类高分子材料该类聚合物作为药物载体时，可使释药时程持续几天乃至几年，研究开发该类聚合物已成为药物传递系统领域的研究“热点” 29。自从 1971 年研究人员利用天然可降解多糖作为配体修饰药物载体靶向蛋白质受体实现局部靶向后，人们开始重视多糖化学与给药体系之间的研究。多糖可以传递大量的信息，而大分子通过特异性修饰及其本身所固有的物理化学性能可实现主动靶向给药。果胶多糖来源丰富，具有良好的生物相容性和低毒性，在体内被特异性酶降解并代谢，其分解产物对人体健康无害，因此被广泛用作生物医用材料 30-32。果胶是应用最广泛的天然多糖之一， 由主链和侧链两部分组成，主链结构为由 -1，4 糖苷键连接的 D-半乳糖醛酸单元直链形成的高聚半乳糖醛酸，侧链由短的呈毛发状的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖构成 33,34。其带有大量的半乳糖残基，而半乳糖可以与ASGPR 结合，从而实现主动靶向肝实质细胞的作用。我们课题组前期已经合成果胶基载药纳米粒子，并对其粒径，形貌，载药量，体外释药的特点进行了研究 34。本研究的目的就是对载药纳米粒子在体外的细胞毒性，细胞摄取及体内的药代动力学进行评价。果胶基纳米载药体系本身带有大量的半乳糖残基这种天然靶头，因此无需通过化学合成法修饰半乳糖靶向头基，操作步骤简单，不会引入副产物，不会污染环境等优势。8第二章 果胶基纳米载药体系的体外抗肿瘤作用研究去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是一种跨膜蛋白，主要存在于哺乳动物肝实质细胞表面能专一识别分子末端带有半乳糖残基的糖蛋白，并与之结合，定向转运到肝细胞内的溶酶体进行代谢。研究发现，某些肿瘤细胞表面，如 HepG2、Caco-2、HT-29 细胞等，ASGPR 高表达，人肺癌细胞 A549 细胞表面几乎没有去唾液酸糖蛋白受体的表达 35,所以，我们选了 HepG2 细胞作为实验细胞，A549 细胞作为对照细胞分别用 MTT 法和高效液相色谱法（HPLC）测定空白载体的细胞毒性和载药纳米粒子对两种细胞的增殖抑制率及两种细胞对两种剂型的细胞摄取情况。初步研究果胶基载 5-FU 纳米粒子（5-FU-NPs）的体外抗肿瘤作用及其肿瘤靶向性，为动物体内试验打下基础。2.1 主要材料与试剂2.1.1. 细胞株人肝癌细胞（HepG2 ）购于中科院上海生命科学研究院，人肺癌细胞（A549）由南华大学陈临溪实验室友情提供。2.1.2.主要试剂与耗材5-氟尿嘧啶（5-FU） 美国 Sigma 公司果胶 美国 Sigma 公司碳酸氢钠 上海国药 氢氧化钙 天津科密欧有限公司 MTT 美国 Amresco 公司乙腈 天津科密欧有限公司 胎牛血清 美国 Gibico 公司新生牛血清 杭州四季青公司双抗 美国 Hyclone 公司HBSS 美国 Hyclone 公司 DMEM 培养基 美国 Hyclone 公司胰蛋白酶 杭州碧云天DMSO 北京索莱宝科技有限公司9PBS 北京舟鼎国公司半乳糖 杭州阿拉丁公司6 孔板、96 孔板 美国 Costar 公司2.2 主要仪器旋涡混合器 大龙兴创实验仪器（北京）有限公司HP-1100 型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司SZ-93 自动双蒸水蒸馏器 中国上海亚荣生化仪器厂电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂恒温震荡器 SHA-B 天津市泰斯特有限公司电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司碎花型制冰机 哈尔滨东联电子厂 HZS-HFORMA 超低温冰箱 美国 FORMA 公司5810R 高速冷冻离心机 德国 Enppendorf 公司FORMA3111CO2 水套培养箱 美国 FORMA 公司NIKON-TMS-310867 显微镜 日本 Nikon 公司SW-CT-2FS 洁净工作台 苏州净化设备公司去离子水纯水仪 中国上海亚荣生化仪器厂酶联免疫检测仪 Elx-800 型 Bio-Tek 公司2.3 实验方法2.3.1 果胶基载 5-FU 纳米粒子的制备0.1 g 的果胶溶于 5 mL 双蒸水中，55水浴，磁力搅拌（600 rpm）半个小时后滴入 0.01 M 的 Ca(OH)2 1 mL，继续搅拌 1 个小时，然后向溶液中滴加入 3 mL NaHCO3，继续搅拌 3 个小时，加入 0.1 g 5-FU 继续搅拌 24 小时，然后在20水浴中降温半个小时后放入透析袋中透析 24 小时既得到载 5-FU 果胶基纳米粒子，放入 4冰箱中待用。2.3.2 细胞培养采用含 100 U/mL 青霉素，0.1 mg/mL 链霉素、10%胎牛血清的 DMEM（RPMI1640，用于 A5