肝细胞肝癌中转录因子FOXM1表达的临床意义及其调控AFP表达与分泌的分子机制研究-临床检验诊断学

1英汉缩略语名词对照英文缩写 英文全称 中文全称ACP5 tartrate-resistantacid phosphatase 5 耐酒石酸酸性磷酸酶 5AFP alpha-fetoprotein 甲胎蛋白Afr1 alpha-fetoprotein regulator 1 甲胎蛋白调节因子 1Afr2 alpha-fetoprotein regulator 2 甲胎蛋白调节因子 2BME beta-mercaptoethanol -巯基乙醇bp base pair 碱基对BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白Zbtb20 Zinc finger and BTB domain containing 20BTB 锌指蛋白 20cDNA complementary DNA 互补 DNAddH2O double distilled water 双蒸水DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸DNase deoxyribonuclease DNA 酶FOXM1 Forkhead box transcription factor M1 转录因子 FOXM1FBS fetal bovine serum 胎牛血清FQ-PCR fluorescence quantitative PCR 荧光定量 PCRFTF fetoprotein transcription factor 胚胎蛋白转录因子GFP green fluorescent protein 绿色荧光蛋白HCC hepatocellular carcinoma 肝细胞肝癌HNF1 hepatocyte nuclear factor 1 肝细胞核因子 1HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶KD kilodalton 千道尔顿M mol/L 摩尔/升MEM Eagles minimum essential medium 最低必需培养液MMPs matrix metalloproteinases 基质金属蛋白酶2MOI multiplicity of infection 感染复数mg milligram 毫克ml milliliter 毫升min minute 分钟mRNA messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸NFI nuclear factor I 核因子 Ing nanogram 纳克OD optical density 光密度PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应pH potential of hydrogen 酸碱度PS Penicillin-Streptomycin 青/链霉素Raf Regulator of alpha-fetoprotein 甲胎蛋白调节因子RNA ribonucleic acid 核糖核酸RNase ribonuclease RNA 酶s second 秒SDS sodium dodecyl sulfute 十二烷基硫酸钠Tris tris hydroxymethyl amino methane 三羟甲基氨基甲烷l microlitre 微升M micromol/L 微摩尔/升g microgram 微克VEGF vascular endothelial growth factor 血管内皮生长因子Zhx2 Zinc-fingers and homeoboxes 2 锌指同源框蛋白 2摘 要目的：研究人肝细胞肝癌（HCC）中转录因子 FOXM1 表达的临床意义及其调控 AFP 表达与分泌的分子机制。3方法：（1）采用 Western blot 技术检测 52 例 HCC 患者肝癌组织中FOXM1 蛋白的表达，并分析其与 HCC 患者临床病理特征的关系；（2）采用荧光定量 PCR 技术检测 HCC 患者肝癌组织中 AFP mRNA 表达水平，电化学发光法检测患者术前血清 AFP 分泌水平，通过 Pearson 相关性分析方法分析 HCC 患者癌组织中 FOXM1 蛋白表达水平和 AFP mRNA 表达水平及术前血清 AFP 分泌水平三者的相关性；（3）最佳 MOI 的重组 FOXM1 腺病毒分别感染 AFP 高表达的HepG2、HepG2.2.15 细胞和 AFP 低表达的 SMMC7721 细胞，感染 24 h 后通过荧光定量 PCR 技术验证细胞内 FOXM1 mRNA 表达情况，感染 48 h 后通过 Western blot 技术验证细胞内 FOXM1 蛋白表达情况及其下游基因 cyclinB1 蛋白表达变化情况；（4）以最佳 MOI 的重组 FOXM1 腺病毒感染HepG2、HepG2.2.15 和 SMMC7721 细胞，感染 24 h 后通过荧光定量PCR 检测 FOXM1 蛋白对 AFP mRNA 表达的影响，感染 48 h 通过Western blot 和电化学发光法观察 FOXM1 蛋白对 AFP 蛋白的表达及分泌的影响。结果：（1）FOXM1 表达与 HCC 肿瘤大小和淋巴转移有关（P 1=0.039，P 2=0.039） ，而与年龄、性别、肝硬化、HBV 感染状态和肿瘤分期无关。4（2）HCC 患者肝癌组织中 FOXM1 蛋白表达水平与 AFP mRNA表达水平及术前血清 AFP 分泌水平均呈正相关（r=0.448 ，P=0.001 ； r=0.381，P=0.005） 。 （3）HepG2 和 HepG2.2.15 细胞中 FOXM1 可显著促进 AFP mRNA 和蛋白的表达及 AFP 的分泌；SMMC7721 细胞中 FOXM1 仅可促进 AFP mRNA 的表达，但不能促进 AFP 蛋白的表达和分泌。结论：（1）人肝细胞肝癌中 FOXM1 表达与肿瘤大小和淋巴转移有关，FOXM1 在 HCC 肿瘤发展和转移过程中可能发挥重要作用；（2）人肝细胞肝癌中 FOXM1 表达与 AFP 的表达与分泌密切相关，FOXM1 可能通过调节 AFP 的转录在促进 AFP 表达中发挥重要作用。关键词：肝细胞肝癌；FOXM1；AFP mRNA；Alpha-fetoprotein；5EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF FOXM1 IN HUMAN HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND THE MOLECULAR MECHANISM OF FOXM1-REGULATED AFP EXPRESSIONABSTRACTObjective: To investigate the expression and significance of forkhead box M1 (FOXM1) in human hepatocellular carcinoma (HCC) and the relationship between FOXM1 and Alpha-fetoprotein (AFP).Methods: (1) FOXM1 protein in 52 HCC tissues were detected by Western blot, and the relationship between FOXM1 and clinical characteristics of HCC was analyzed ;(2) AFP mRNA levels in HCC tissues were validated by FQ-PCR, preoperative serum AFP was detected by electrochemiluminescence method, and the correlations among FOXM1, AFP mRNA and preoperative serum AFP were analyzed by Pearson correlation analysis metheod; (3) HepG2, HepG2.2.15 (AFP high-expressing hepatoma cells) and SMMC7721 (AFP low/no-expressing hepatoma cells) cells were treated with Ad-FOXM1 adenovirus, after which the expression level of FOXM1 mRNA was evaluated by FQ-PCR by 24 h, the progression of cell cycle 6and the expression of FOXM1 protein and cyclinB1 protein was respectively detected by flow cytometry and Western blot by 48 h; (4)HepG2, HepG2.2.15 and SMMC7721 cells were treated with Ad-FOXM1 adenovirus, after which the effects of FOXM1 protein on the expression and secretion of AFP mRNA and protein were analyzed by FQ-PCR, Western blot and electrochemiluminescence method, respectively. Results: (1)Over-expression of FOXM1 was associated with the tumor size and lymphatic metastasis (P1=0.039, P2=0.039), but not age, sex, HBV infection status, cirrhosis and tumor differentiation in HCC.(2) FOXM1 protein expression level was positively correlated with both AFP mRNA and preoprative serum AFP (r=0.448, P=0.001; r=0.381, P=0.005), meanwhile, AFP mRNA in HCC tissues was positively correlated with serum AFP (r=0.542，P=0.00004). (3) FOXM1 could increase the expression of AFP both in mRNA and protein level in HepG2 and HepG2.2.15 cells, concomitant with up-regulated AFP secretions. While on the other hand, FOXM1 could only increase the expression of AFP mRNA in SMMC7721 cells, not the expression and secretion of AFP.Conclusion: (1) Over-expression of FOXM1 in HCC was associated with tumor size and lymphatic metastasis, FOXM1 might be associated with the 7development and metastasis of HCC.(2) The expression of FOXM1 correlates with both in vivo and in vitro AFP production in Human hepatocellular carcinoma, FOXM1 may play an important role in regulating the expression of AFP.Key words: hepatocellular carcinoma; forkhead box M1; AFP mRNA; Alpha-fetoprotein8前 言肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是一种常见的恶性肿瘤，位居全球常见恶性肿瘤的第七位，每年有近 700 000 患者死亡，是造成肿瘤患者死亡的第三大杀手 1。近年来，HCC 的治疗措施有了显著进展，如除了传统的放化疗治疗方法外，还可使用射频消融术（RFA） 、动脉化疗栓塞术(TACE)等局部处理技术或肝移植术（LTX ） ，但由于其发病机制仍未完全明了，且病程进展迅速，明确诊断时多已处于晚期，使得 HCC 死亡率仍居高不下 2。因此，探讨 HCC 发病的分子机制并藉此寻找新的生物学标志物应用于诊断和预后判断，对于延长HCC 患者的生存期具有至关重要的作用。FOXM1 转录因子是 FOX 转录因子（forkhead helix transcription factor）家族成员之一，该家族成员以一个同源保守性的翼状 DNA 结构域为特征，具有转录调节和 DNA 修复等功能，是关键性的细胞周期调节因子 3。研究表明，FOXM1在多种恶性肿瘤中高表达 4-10。已有实验数据证实，FOXM1 表达增高与小鼠肝癌形成的易感性有关，在小鼠肝癌形成中不可或缺 11。相反，敲除肝癌细胞中FOXM1 基因可抑制肝癌细胞增殖，引起细胞周期停滞并抑制肝癌细胞的侵袭性，影响肝癌的发展和结局 12。由此可见，FOXM1 对肝细胞肝癌的形成具有重要意义。血清甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP) 是肝细胞肝癌最常用的的特异性标志物，在 HCC 的发生、发展、诊断和疗效评估中具有重要价值 13-16。分析 AFP 基因表达谱发现：AFP 在胎肝中高水平表达，出生后数周后表达大幅降低，但当肝细胞再生或癌变时，AFP 转录即被重新激活而分泌产生大量 AFP 17，AFP 再活化在肝细胞恶性转化和 HCC 发生发展过程中发挥关键性作用。但关于 AFP 基因在HCC 发生过程中被再活化的分子机制仍然是未解之谜，也因此而成为肝癌领域的研究热点 18。已有研究证实，FOXM1 和 AFP 在肝脏组织内的时空表达模式呈现出惊人的消长一致性：即胎儿期均主要由胎儿肝细胞合成，出生后两者的合成逐渐停止，9但当肝细胞再生或发生癌变时，这两种蛋白的基因重新被激活，可重新大量表达19。但是，在肝细胞恶性转化过程中 FOXM1 是否能够调节 AFP 的再活化，促进其表达与分泌尚不清楚。因此，本课题将首先检测 FOXM1 在 HCC 肝癌组织中的蛋白表达水平，分析 FOXM1 与 HCC 临床病理特征间的相关性；再通过检测 HCC 肝癌组织中 AFP mRNA 及术前血清 AFP 分泌水平，分析肝癌组织中 FOXM1 蛋白表达水平和AFP mRNA 表达水平及术前血清 AFP 分泌水平的相关性；最后，通过检测肝癌细胞株中 FOXM1 的表达对 AFP 表达和分泌水平的影响，探讨 FOXM1 调控 AFP表达及分泌的分子机制，以了解 FOXM1 在人肝细胞肝癌发生发展中的意义。本研究分为三个部分：（一）肝细胞肝癌中 FOXM1 表达的临床意义以 HCC 患者临床组织标本为研究对象，通过 Western blot 技术检测其中FOXM1 蛋白的表达，分析其与 HCC 患者临床病理特征的关系；（二）重组 FOXM1 腺病毒表达载体的构建及表达效果验证构建并纯化重组 FOXM1 腺病毒（Ad-FOXM1 ）和重组 GFP 腺病毒（Ad-GFP） 。分别用不同 MOI 的 Ad-GFP 感染细胞株，培养 48 h 后观察 GFP 荧光蛋白表达水平，确定最佳 MOI；以最佳 MOI 的 Ad-FOXM1 感染细胞株，感染 24 h 后采用荧光定量 PCR 技术检测细胞内 FOXM1 mRNA 表达情况，感染 48 h 后采用Western blot 技术检测细胞内 FOXM1 蛋白及其下游基因 cyclinB1 蛋白表达变化情况。（三）HCC 中 FOXM1 调控 AFP 的表达及分泌的分子机制研究初探以 HCC 临床标本和人肝癌细胞株为研究对象，采用荧光定量 PCR 技术检测HCC 患者肝癌组织中 AFP mRNA 表达水平，电化学发光法检测患者术前血清AFP 分泌水平，Pearson 相关性分析方法分析 HCC 患者癌组织中 FOXM1 蛋白和AFP mRNA 表达水平及术前血清 AFP 分泌水平三者的相关性；以最佳 MOI 的重组 FOXM1 腺病毒感染人肝癌细胞株，感染 24 h 后通过荧光定量 PCR 检测FOXM1 蛋白对 AFP mRNA 表达的影响，感染 48 h 通过 Western