绿色荧光蛋白及其在丝状真菌研究中的应用

专 论 与 综 述Revie ws收 稿 日 期 : 2008202228 修 订 日 期 : 2008207207基 金 项 目 : 中 荷 科 学 战 略 联 盟 项 目 (2004CB720407) ;农 业 部 公 益 性 行 业 科 研 专 项 (nyhyzx072048)3 通 讯 作 者 绿 色 荧 光 蛋 白 及 其 在 丝 状 真 菌 研 究 中 的 应 用徐 莹 1 ,2 , 刘 太 国 1 , 何 月 秋 2 , 陈 万 权 13(1. 中 国 农 业 科 学 院 植 物 保 护 研 究 所 , 植 物 病 虫 害 生 物 学 国 家 重 点 实 验 室 , 北 京 100193 ;2. 云 南 农 业 大 学 , 昆 明 650201)摘 要 绿 色 荧 光 蛋 白 (green fluorescent protein , GFP) 来 源 于 海 洋 生 物 水 母 ( A equorea victoria) , g f p 基 因 作 为 报告 基 因 已 被 广 泛 地 应 用 于 丝 状 真 菌 生 物 学 研 究 中 。 g f p 基 因 通 过 与 目 标 基 因 融 合 ,可 进 行 真 菌 的 蛋 白 质 及 细 胞 器定 位 、 细 胞 动 力 学 、 突 变 体 致 病 力 检 测 、 生 态 学 行 为 以 及 与 其 他 生 物 互 作 等 研 究 。关 键 词 绿 色 荧 光 蛋 白 ( GFP) ; 丝 状 真 菌 ; 报 告 基 因中 图 分 类 号 S 432. 44 ; Q 816Application of green fluorescent protein to the studies on f ilamentous f ungiXu Ying1 ,2 , Liu Taiguo1 , He Yueqiu2 , Chen Wanquan1(1. S tate Key L aboratory f or B iology of Plant Diseases and I nsect Pests , I nstitute ofPlant Protection , CA A S , B ei j ing 100193 , China; 2. Yunnan A g ricultural Universit y , Kunming 650201 , Chi na)Abstract The g f p gene from the jellyfish A equorea victoria encoding green fluorescent protein ( GFP) is widelyused as a reporter gene in the research of filamentous fungi. Through fusion with the target gene , GFP can be ap2plied to locating some proteins and organelles , understanding the cell dynamics and detecting mutants of fungal path2ogenicity , and to the study on the interaction between different fungi.Key words green fluorescent protein ( GFP) ; filamentous fungus ; reporter gene绿 色 荧 光 蛋 白 ( green fluorescent p rotein ,GFP) 来 源 于 海 洋 生 物 水 母 ( A equorea victori a) ,由于 其 具 有 稳 定 、 直 观 、 操 作 方 便 的 荧 光 性 质 和 不 需 添加 外 源 底 物 就 可 以 在 活 细 胞 中 直 接 检 测 等 无 可 比 拟的 优 点 ,以 g f p 基 因 作 为 报 告 基 因 已 经 广 泛 地 应 用于 丝 状 真 菌 分 子 生 物 学 研 究 中 。 玉 米 黑 粉 菌 ( Usti2l ago m ay dis) 是 第 一 个 成 功 应 用 GFP 的 丝 状 真菌 1 ,随 后 作 为 报 告 基 因 g f p 应 用 于 构 巢 曲 霉 ( A s2pergill us ni d ul ans) 223 和 出 芽 短 梗 霉 ( A ureobasi di2um p ull ul ans) 4 。 酵 母 是 g f p 基 因 在 真 菌 中 应 用较 多 的 真 菌 之 一 5 。 目 前 , g f p 已 在 12 个 属 16 个种 的 丝 状 真 菌 中 表 达 ,包 括 炭 疽 菌 属 ( Colletot ri2chum) 627 、 球 腔 菌 属 ( M ycos p haerell a) 8 、 大 角 间 座壳 属 ( M agna port he) 9210 、 旋 孢 腔 菌 属 ( Cochliobo2l us) 11 、 木 霉 属 ( T richoderm a) 12213 、 柄 孢 壳 菌 属( Podos pora) 14 、 核 盘 菌 属 ( S cleroti ni a) 15 、 裂 褶菌 属 ( S chi z op hy ll um) 16 、 曲 霉 属 17219 ( A s pergil2l us) 和 疫 霉 属 ( Phy top ht hora) 20221 。 本 文 对 GFP 发光 特 性 、 发 光 机 制 、 应 用 特 点 及 其 在 丝 状 真 菌 生 物 学方 面 的 应 用 进 行 了 回 顾 与 展 望 。1 GFP 的 发 光 特 性 与 机 制GFP 是 从 水 母 分 离 出 的 一 种 天 然 荧 光 蛋 白 ,由238 个 氨 基 酸 残 基 组 成 的 单 链 多 肽 ,其 荧 光 发 射 峰在 509 nm ,最 大 激 发 波 长 为 395 nm ,并 在 470 nm处 有 一 肩 峰 , GFP 的 化 学 性 质 相 当 稳 定 ,其 变 性 需在 90 或 p H 12. 0 的 条 件 下 用6 mol/ L盐 酸 胍 处 理 。 GFP 的 荧 光 发 光 机 制 尚 不 十1专 论 与 综 述第 34 卷 第 6 期 (2008)PLAN T PRO TECTION Vol. 34 No. 6 (2008)分 清 楚 ,Morise 等 人 曾 提 出 一 个 能 量 传 递 模 式 图 来解 释 水 母 的 发 光 机 制 ,但 并 未 获 得 认 同 。 Chattoaj等 对 GFP 进 行 了 光 谱 分 析 22 ,结 合 前 人 工 作 提 出GFP 有 两 个 明 显 的 吸 收 带 ,对 应 于 GFP 的 两 种 不 同构 象 的 基 态 A 和 B。 基 态 A 对 应 于 395 nm 的 吸 收峰 ,基 态 B 对 应 于 475 nm 的 吸 收 峰 ,基 态 A 占 优势 ,基 态 B 的 分 子 数 量 约 是 基 态 A 的 1/ 6 ,两 种 基 态间 能 缓 慢 地 转 换 ,但 激 发 态 A 3 之 间 的 转 换 很 快 且发 生 了 质 子 转 移 , A 3 快 速 高 效 地 衰 变 至 另 一 激 发态 ,应 该 存 在 一 个 中 间 过 度 态 I ,质 子 转 移 使 A 3 转变 成 I3 ,I3 回 迁 到 基 态 I 时 产 生 发 射 峰 504 nm 的荧 光 ,构 象 改 变 使 I3 转 变 成 B 3 ,由 B 3 到 B 发 射 荧光 而 不 发 生 质 子 转 移 。 目 前 ,对 于 GFP 的 作 用 机 理较 为 认 同 的 仅 仅 是 : GFP 是 生 物 发 光 过 程 中 的 能 量受 体 ,并 且 是 最 终 的 发 光 体 ,不 同 的 生 物 发 光 机 制 各不 相 同 ,不 同 的 突 变 体 发 光 机 制 也 有 很 大 差 异 。2 GFP 的 应 用 特 点GFP 作 为 备 受 青 睐 的 标 记 基 因 ,在 短 短 几 年 时间 内 便 得 以 广 泛 应 用 , 其 原 因 在 于 它 具 有 以 下优 点 23224 :2. 1 易 于 检 测 、 无 毒 害 、 可 进 行 活 细 胞 定 时 定 位 观 察GFP 荧 光 反 应 不 需 要 外 加 底 物 和 辅 助 因 子 ,只需 紫 外 光 或 蓝 光 激 发 ,即 可 发 出 绿 色 荧 光 ,用 荧 光 显微 镜 甚 至 肉 眼 就 可 以 观 察 到 ,且 灵 敏 度 高 ,对 于 单 细胞 水 平 的 表 达 也 可 识 别 。 从 目 前 的 研 究 结 果 来 看 ,GFP 对 生 活 的 细 胞 基 本 无 毒 害 ,对 目 的 基 因 的 功 能也 没 有 影 响 ,转 化 后 细 胞 仍 可 连 续 传 代 。 对 活 细 胞中 蛋 白 的 功 能 研 究 ,更 能 接 近 自 然 真 实 的 状 态 。 通过 GFP 可 实 时 观 察 到 外 界 信 号 刺 激 下 ,目 的 蛋 白 的变 化 过 程 ,借 助 于 近 来 广 泛 使 用 的 激 光 扫 描 共 聚 焦显 微 镜 ,结 合 强 大 的 计 算 机 软 件 ,可 进 行 三 维 显 示 。2. 2 荧 光 稳 定GFP 对 光 漂 白 有 较 强 的 耐 受 性 ,能 耐 受 长 时 间的 光 照 ; GFP 在 p H7 12 范 围 内 也 能 正 常 发 光 ;对高 温 (70 ) 、 碱 性 、 除 垢 剂 、 盐 、 有 机 溶 剂 等 都 有 较强 抗 性 。2. 3 通 用 性表 现 在 GFP 的 表 达 几 乎 不 受 种 属 范 围 的 限 制 ,在 微 生 物 、 植 物 、 动 物 中 都 获 得 了 成 功 的 表 达 ;其 次是 GFP 没 有 细 胞 种 类 和 位 置 上 的 限 制 ,在 各 个 部 位都 可 以 表 达 发 出 荧 光 。2. 4 易 于 构 建 载 体由 于 GFP 分 子 量 较 小 ,仅 为 27 30 ku ,编 码GFP 的 基 因 序 列 也 很 短 , 为 2. 6 kb ,所 以 很 方 便 地同 其 他 序 列 一 起 构 建 多 种 质 粒 ,而 不 至 于 使 质 粒 过大 影 响 转 化 频 率 。2. 5 易 于 得 到 突 变 体GFP 中 氨 基 酸 的 替 换 可 产 生 不 同 光 谱 特 性 的突 变 体 ,且 增 强 了 荧 光 强 度 ,适 合 在 不 同 物 种 中 专 性表 达 。3 GFP 在 丝 状 真 菌 研 究 中 的 应 用3. 1 GFP 作 为 报 告 基 因GFP 作 为 报 告 基 因 所 表 现 出 的 特 性 尤 为 突 出 。通 过 GFP 可 探 测 基 因 表 达 和 蛋 白 定 位 ,并 可 在 单 个生 物 体 中 持 续 显 影 成 像 ,而 用 其 他 报 告 基 因 标 记 蛋白 ,只 能 短 时 间 观 察 ,并 且 每 个 数 据 点 都 来 源 于 不 同的 个 体 。 GFP 体 内 探 测 不 需 要 其 他 作 用 物 ,也 不 需要 将 其 固 定 在 某 个 组 织 上 ,因 此 , GFP 成 为 人 们 深入 了 解 转 化 以 及 基 因 表 达 的 有 效 工 具 。 此 外 ,在 所有 的 培 养 物 中 使 用 荧 光 计 可 轻 松 量 化 g f p 基 因 表达 3225 ,或 使 用 共 聚 焦 显 微 镜 在 单 个 细 胞 内 、 亚 细 胞成 分 内 量 化 g f p 基 因 表 达 26227 。 通 过 观 察 附 着 胞的 形 成 过 程 ,就 可 在 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 到 稻 瘟 病菌 中 EGF P1 与 钙 调 蛋 白 基 因 融 合 后 的 表 达 ,这 就表 明 CAMmg (稻 瘟 病 菌 钙 调 蛋 白 ) 的 表 达 需 要 分 生孢 子 表 面 附 着 。 通 过 增 加 植 物 表 面 蜡 的 含 量 可 以 阻止 附 着 胞 的 侵 入 25 。 在 稻 瘟 病 菌 中 28 ,将 SGFP 与m p g1 基 因 的 增 强 子 融 合 在 一 起 来 研 究 真 菌 疏 水 蛋白 的 功 能 关 系 ,研 究 发 现 分 生 孢 子 中 的 荧 光 蛋 白 并没 有 迁 移 到 菌 丝 ,表 明 m g p1 的 表 达 受 到 分 生 孢 子生 长 的 限 制 。 在 玉 米 真 菌 病 原 体 中 , SGFP 与 受 碳源 调 节 的 Crgl 增 强 子 融 合 ,用 树 胶 醛 糖 诱 导 病 菌 使产 生 转 化 子 ,并 且 SGFP 所 发 出 的 荧 光 不 干 扰 Crgl的 Nort hern 印 迹 分 析 。 为 了 证 明 在 一 些 个 体 中 ,SGFP 能 够 非 常 稳 定 的 量 化 Crgl 的 表 达 ,并 且 SG2FP 很 可 聚 集 ,因 此 要 在 其 他 的 转 化 子 中 降 低 荧 光量 29 。 编 码 多 聚 半 乳 糖 醛 内 切 酶 的 cl p g2 与 SGFP融 合 ,可 在 分 生 孢 子 萌 芽 以 及 形 成 附 着 孢 的 早 期 阶2第 34 卷 第 6 期 (2008)PLAN T PRO TECTION Vol. 34 No. 6 (2008)专 论 与 综 述段 用 荧 光 显 微 镜 观 察 ,然 后 使 用 反 转 录 PCR 确 定 此基 因 表 达 的 类 型 6 。g f p 基 因 表 达 后 发 生 融 合 从 而 估 测 基 因 的 表 达和 蛋 白 质 定 位 也 成 功 应 用 到 真 菌 当 中 。 玉 米 真 菌 病原 体 的 KIN2 蛋 白 与 SGFP 融 合 产 生 一 个 功 能 融 合蛋 白 ,事 实 上 融 合 蛋 白 中 的 GFP 和 其 他 蛋 白 的 结 构域 都 能 同 时 发 挥 作 用 这 就 能 够 在 不 同 的 生 理 环 境 中准 确 的 研 究 细 胞 中 的 蛋 白 30 。 2008 年 , Soo ChanLee 等 将 GFP 用 于 细 胞 定 位 方 面 的 研 究 31 。 通 过构 建 参 与 泡 囊 组 装 以 及 运 输 的 一 类 重 要 蛋 白 ArfA与 s GFP 的 质 粒 来 标 记 ArfA ,在 荧 光 显 微 镜 下 观察 ,ArfA 定 位 在 高 尔 基 体 内 。 并 进 一 步 用 高 尔 基 体运 输 抑 制 剂 布 雷 菲 (尔 )德 菌 素 处 理 ,观 察 GFP 后 发现 ArfA 扩 散 到 泡 液 中 并 堆 积 在 亚 细 胞 室 内 ,表 明ArfA 定 位 并 工 作 于 高 尔 基 体 网 络 中 。GFP 在 体 外 致 病 基 因 表 达 中 的 研 究 也 有 应 用 ,2005 年 , B. Clayton 使 用 GFP 作 为 AL S 启 动 子 活性 的 报 告 者 ,并 通 过 流 动 细 胞 计 数 的 方 法 度 量 所 培养 的 白 色 念 珠 菌 ( Candi d a albicans) 细 胞 中 产 生 的荧 光 信 号 ,使 体 外 构 建 报 告 菌 株 研 究 AL S 基 因 表 达成 为 可 能 32 。3. 2 GFP在 细 胞 动 力 学 中 的 应 用GFP 被 广 泛 地 用 于 丝 状 真 菌 细 胞 亚 结 构 的 研究 ,并 具 独 特 的 效 果 33 。 例 如 ,丝 状 真 菌 的 细 胞 核在 生 成 后 要 运 动 很 长 一 段 距 离 才 能 到 达 菌 丝 顶 端 ,经 过 用 GFP 标 记 了 一 个 核 定 位 信 号 的 构 巢 曲 霉 ,其细 胞 核 区 会 发 出 明 亮 的 荧 光 ,从 而 可 用 于 观 察 细 胞核 的 迁 移 和 孢 子 萌 发 过 程 中 有 丝 分 裂 的 情 况 3 。 用此 方 法 观 察 到 了 一 些 有 趣 的 现 象 ,例 如 同 一 菌 丝 中的 细 胞 核 并 不 是 同 时 分 裂 ,而 是 由 顶 端 往 下 存 在 一个 时 间 梯 度 ,因 此 推 测 有 丝 分 裂 的 时 间 差 由 一 种 可扩 散 的 因 子 控 制 。 最 近 Steidl 等 又 报 道 了 利 用 GFP对 核 定 位 进 行 研 究 的 最 新 进 展 34 。 构 巢 曲 霉 的 Ua2pC 蛋 白 是 一 种 高 亲 和 力 、 中 等 容 量 的 尿 酸 黄 嘌 呤 的运 输 载 体 ,Valdez2Taubas 等 用 UapC 与 GFP 融 合的 方 法 ,对 细 胞 内 吞 作 用 的 发 生 及 液 泡 中 溶 酶 体 和内 体 的 功 能 进 行 了 有 意 义 的 探 索 35 。 Golvesin 是一 种 在 盘 基 网 柄 菌 属 ( Dict yosteli um) 细 胞 中 与 高 尔基 体 膜 及 高 尔 基 分 泌 小 泡 的 膜 有 关 的 蛋 白 质 ,为 了对 高 尔 基 体 进 行 活 细 胞 内 的 功 能 研 究 ,Natalie 等 用GFP 与 Golvesin 的 C2末 端 及 N2末 端 分 别 进 行 融合 36 ,并 借 助 特 异 性 抗 体 及 其 他 标 记 来 定 位 GFP与 Golvesin 融 合 蛋 白 ,试 验 结 果 显 示 GFP 融 合 或 非GFP 融 合 蛋 白 的 定 位 相 同 , GFP 堵 塞 C2末 端 会 导 致此 蛋 白 滞 留 于 高 尔 基 体 内 ,表 明 自 由 的 C2末 端 是Golvesin 从 高 尔 基 体 转 移 到 细 胞 其 他 部 分 所 必 需的 ,并 且 用 此 方 法 还 精 确 地 测 算 出 高 尔 基 体 潴 泡 上的 小 管 的 伸 出 速 率 可 达 3 4 m/ s。 在 有 丝 分 裂 过程 中 , 融 合 蛋 白 一 直 保 留 在 高 尔 基 小 泡 中 ,因 此 可以 观 察 到 在 胞 质 分 割 时 高 尔 基 体 的 解 体 与 重 建 。GFP 还 可 以 用 来 标 记 有 丝 分 裂 过 程 中 的 重 要反 应 酶 37 ,从 而 研 究 此 酶 在 有 丝 分 裂 过 程 中 可 能 发挥 的 作 用 。 利 用 GFP 标 记 PL KA ,进 行 活 体 监 测 明确 了 活 体 细 胞 中 PL KA 的 超 量 表 达 与 定 位 决 定 着PL KA 的 功 能 ,PL KA 的 超 量 表 达 可 以 促 使 菌 丝 形成 ,但 是 阻 碍 细 胞 间 期 的 核 分 裂 。3. 3 GFP 在 突 变 体 致 病 力 检 测 中 的 应 用近 年 来 ,植 物 转 基 因 技 术 取 得 了 引 人 注 目 的 成就 。 T2DNA 和 转 座 子 作 为 植 物 基 因 的 插 入 突 变 已广 泛 应 用 于 基 因 的 标 签 和 分 离 中 ,从 而 成 为 发 现 新基 因 非 常 有 效 的 手 段 。 但 是 ,在 将 转 座 子 转 进 目 标菌 ,筛 选 致 病 力 增 强 或 减 弱 菌 株 时 却 遇 到 了 耗 时 量大 ,不 易 观 察 到 微 观 侵 染 与 扩 展 的 难 题 ,但 g f p 基因 的 应 用 解 决 了 这 一 难 题 ,人 们 可 以 将 g f p 基 因 转化 受 体 菌 ,与 野 生 型 菌 进 行 比 较 来 直 观 观 察 菌 株 的致 病 力 。 2005 年 ,Ben M Barek 等 (私 人 交 流 ) 将 含有 mi m p1 转 座 子 的 pNm1 H181 质 粒 和 含 有 选 择 标记 的 p H E06 质 粒 共 转 化 小 麦 禾 谷 镰 刀 菌 ( Fusari2um g rami nearum) ,可 获 得 突 变 体 ,但 突 变 体 在 进 行鉴 定 时 有 一 定 困 难 ,无 法 观 察 到 在 寄 主 体 内 的 扩 展状 况 ,刘 太 国 等 (私 人 交 流 ) 再 将 含 有 g f p 基 因 的 质粒 转 化 到 含 有 以 上 两 个 质 粒 的 受 体 菌 中 ,获 得 了 稳定 转 化 GFP 的 转 基 因 菌 株 ,筛 选 出 的 突 变 体 在 致 病性 测 定 时 可 直 接 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 菌 丝 的 生 长 与扩 展 状 况 。2007 年 ,Iori Imazaki 等 将 GFP 应 用 到 尖 孢 镰刀 菌 ( F. ox ys porum) 菌 株 中 38 ,用 来 观 察 Fow2 基因 突 变 体 菌 株 的 致 病 性 。 将 GFP 转 入 F. ox ys po2rum 的 野 生 型 菌 株 和 突 变 体 菌 株 中 ,进 而 在 荧 光 显微 镜 下 观 察 用 GFP 标 记 的 野 生 型 菌 株 和 突 变 体 菌3专 论 与 综 述第 34 卷 第 6 期 (2008)PLAN T PRO TECTION Vol. 34 No. 6 (2008)株 的 侵 染 行 为 ,发 现 突 变 体 菌 株 丧 失 侵 染 根 部 并 定殖 植 物 组 织 的 能 力 ,从 而 得 到 无 致 病 力 突 变 菌 株 。3. 4 GFP在 蛋 白 质 表 达 中 的 应 用GFP 在 研 究 丝 状 真 菌 分 泌 型 蛋 白 的 过 程 中 发挥 了 重 要 作 用 。 黑 曲 霉 ( A s pergill us ni ger) 用 于 生产 异 源 蛋 白 质 ,但 产 量 普 遍 低 于 产 生 同 源 蛋 白 质 的菌 株 。 尽 管 有 证 据 表 明 丝 状 真 菌 蛋 白 的 分 泌 机 制 与其 他 的 真 核 细 胞 类 似 ,即 分 泌 蛋 白 集 中 在 菌 丝 顶 端 ,但 却 少 有 阐 述 。 通 过 将 s g f p 整 合 到 黑 曲 霉 葡 萄 糖化 酶 的 启 动 子 区 域 ,使 得 绿 色 荧 光 蛋 白 与 葡 萄 糖 化酶 融 合 ,第 一 次 可 以 在 单 菌 丝 水 平 观 察 到 黑 曲 霉 体内 葡 萄 糖 化 酶 的 分 泌 情 况 39240 。GFP 技 术 成 功 地 应 用 于 葡 糖 糖 化 酶 的 定 量 以研 究 丝 状 真 菌 的 菌 丝 形 态 对 于 蛋 白 分 泌 的 影 响 。2005 年 ,M. Talabardon 等 将 载 有 p gpdA GL A GFP的 质 粒 转 化 进 黑 曲 霉 ,使 得 菌 株 能 够 编 码 GLA2GFP (葡 糖 糖 化 酶 2绿 色 荧 光 蛋 白 ) 融 合 蛋 白 41 。 用3 种 不 同 的 培 养 方 式 得 到 载 有 pgp dA GL A GFP 质粒 的 黑 曲 霉 不 同 的 菌 丝 形 态 (游 离 细 胞 培 养 、 旋 转 纤维 床 、 静 态 纤 维 床 ) ,结 果 表 明 ,融 合 蛋 白 的 表 达 依 赖于 真 菌 的 形 态 。3. 5 GFP在 真 菌 与 其 他 生 物 间 相 互 作 用 以 及 在 真菌 环 境 生 态 学 中 的 应 用2004 年 ,L u Zexun 等 利 用 GFP 标 记 技 术 研 究了 不 同 真 菌 间 的 相 互 作 用 42 。 他 们 通 过 共 聚 焦 扫描 显 微 镜 和 荧 光 立 体 显 微 镜 监 测 标 记 g f p 的 生 防菌 株 木 霉 菌 ( T richoderm a at rovi ri de) 与 土 壤 传 播的 植 物 病 原 物 在 共 培 养 物 或 黄 瓜 种 子 上 的 互 作 ,在原 位 水 平 上 明 确 了 两 者 的 互 作 关 系 。 真 菌 寄 生 菌 丝沿 着 病 原 菌 菌 丝 生 长 ,然 后 卷 曲 ,形 成 类 似 于 钩 状 的特 殊 结 构 。2008 年 , K. Rajasekaran 等 利 用 GFP 标 记 技 术研 究 真 菌 侵 染 棉 花 种 子 及 定 殖 43 。 将 转 入 了 绿 色荧 光 蛋 白 标 记 的 曲 霉 菌 (菌 株 70) 接 种 到 棉 花 种 子中 ,利 用 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记 监 测 真 菌 的 生 长 、 侵 染 途径 、 定 殖 以 及 黄 曲 霉 毒 素 的 产 生 。 分 别 测 量 接 种 后种 子 的 重 量 ,结 果 表 明 重 量 的 减 少 值 相 似 ,即 GFP标 记 菌 株 与 野 生 型 菌 株 在 致 病 力 上 没 有 明 显 差 别 。同 时 利 用 菌 株 产 生 的 绿 色 荧 光 GFP 发 射 的 荧 光 强度 是 蓝 绿 黄 (B GYF) 荧 光 的 10 倍 能 够 鉴 定 、 监 测被 黄 曲 霉 菌 侵 占 的 特 殊 植 物 组 织 ,在 接 种 72 h 内 就能 观 察 到 真 菌 侵 占 了 内 种 皮 和 子 叶 。4 展 望目 前 ,已 经 获 得 了 酵 母 ( S accharom yces cerevi2si ae) 的 基 因 组 全 序 列 ,而 其 他 的 一 些 丝 状 真 菌 的 基因 组 ,包 括 构 巢 曲 霉 ( A s pergill us ni d ul ans ) 、 链 孢霉 ( N euros pora crassa ) ( http : gene. genetics.uga. edu/ ) 、 异 旋 孢 腔 菌 ( Cochliobol us heterost ro2p hus ) 、 玉 米 黑 粉 菌 ( Ustil ago m ay dis ) 、 疫 霉 菌( Phy top ht hora spp . ) 和 稻 瘟 病 菌 ( M ag na port heg risea) 也 已 完 成 测 序 ( http : www. broad. mit .edu/ annotation/ f gi/ ) 。 那 么 这 些 真 菌 中 每 个 基 因的 启 动 子 的 序 列 也 都 将 被 确 定 。 随 着 微 矩 阵 技 术 、数 字 图 像 技 术 、 生 物 信 息 学 技 术 的 飞 速 发 展 和 日 趋完 善 ,能 够 对 亚 细 胞 、 单 个 细 胞 、 整 个 有 机 体 或 单 微矩 阵 的 复 杂 荧 光 图 片 进 行 高 通 量 的 检 测 、 储 存 和 显示 。 因 此 , GFP 技 术 与 这 些 技 术 结 合 起 来 将 对 未 来的 真 菌 生 物 学 产 生 深 远 影 响 。目 前 ,微 矩 阵 技 术 可 以 同 时 分 析 一 个 环 境 的 群体 中 上 百 个 基 因 的 表 达 ,然 而 ,这 需 要 对 有 机 物 或 特定 组 织 在 不 同 时 间 点 进 行 RNA 提 取 和 cDNA 的 合成 。 对 任 何 一 个 基 因 的 功 能 分 析 都 不 仅 包 括 何 种 环境 因 素 刺 激 该 基 因 表 达 ,而 且 包 括 在 哪 种 组 织 、 哪 个时 间 段 产 生 及 其 产 生 的 蛋 白 产 物 的 亚 细 胞 的 位 置 和编 码 该 基 因 表 型 的 等 位 基 因 。 以 g f p 为 报 告 基 因的 转 座 子 、 启 动 子 库 、 PCR 为 目 的 模 块 等 解 决 了 上述 问 题 ,且 已 在 酵 母 和 细 菌 中 应 用 。 真 菌 基 因 组 学及 改 进 的 转 化 技 术 、 高 同 源 重 组 率 、 PCR 和 真 菌 转座 子 的 鉴 定 使 得 已 在 细 菌 和 酵 母 中 成 功 应 用 的 基 因组 研 究 在 丝 状 真 菌 中 成 为 可 能 ,这 些 发 展 可 以 大 量地 进 行 真 菌 基 因 功 能 分 析 ,而 对 于 许 多 丝 状 真 菌 ,低转 化 率 制 约 了 这 一 途 径 。在 复 杂 环 境 中 能 够 高 通 量 筛 选 大 量 通 过 基 因 组方 法 产 生 的 突 变 真 菌 是 从 未 遇 到 的 挑 战 。 在 细 菌 系统 中 ,Sternberg 等 发 明 了 一 种 决 定 细 菌 在 通 流 室 分布 和 生 长 的 技 术 ,该 技 术 将 编 码 不 稳 定 的 GFP 蛋 白的 g f p 基 因 与 rRNA 融 合 ,从 而 可 以 实 时 观 测 细 菌在 复 杂 菌 落 中 的 生 长 和 分 布 ,这 种 发 明 也 可 以 应 用到 真 菌 系 统 中 。 许 多 研 究 人 员 利 用 GFP 标 记 的 真4第 34 卷 第 6 期 (2008)PLAN T PRO TECTION Vol. 34 No. 6 (2008)专 论 与 综 述菌 来 研 究 真 菌 在 自 然 系 统 中 的 分 布 ,改 造 真 菌 所 在的 复 杂 环 境 ,无 论 是 在 实 验 室 或 是 封 闭 的 温 室 内 ,仍存 在 一 些 挑 战 。 由 于 许 多 丝 状 真 菌 可 以 产 生 大 量 的易 于 扩 散 的 孢 子 ,且 这 些 孢 子 在 空 气 中 易 于 积 累 到高 浓 度 ,因 此 操 作 这 些 基 因 改 造 过 的 真 菌 需 在 封 闭的 环 境 内 ,这 些 微 生 物 进 入 环 境 所 带 来 的 生 态 影 响尚 需 评 估 ,特 别 是 那 些 未 知 的 选 择 基 因 必 须 要 慎 重考 虑 。 虽 然 自 转 化 生 物 中 消 除 选 择 标 记 的 技 术 已 经成 熟 ,但 尚 缺 乏 关 于 转 化 真 菌 释 放 到 环 境 中 真 菌 相关 的 适 合 度 、 病 害 流 行 学 及 可 能 引 起 的 生 态 影 响 的研 究 。 目 前 美 国 农 业 部 已 经 同 意 释 放 基 因 改 造 过 的真 菌 ,关 于 释 放 的 条 件 及 其 相 关 的 环 境 评 估 报 告 可在 相 关 网 址 http : www. nbiap . vt . edu/ cf docs/fieldtest s1. cf m 中 找 到 。总 之 ,在 获 取 大 量 真 菌 基 因 组 信 息 的 同 时 , GFP也 在 分 子 工 程 改 造 、 荧 光 探 测 和 图 像 分 析 上 取 得 了相 当 大 的 发 展 ,综 合 利 用 这 些 技 术 和 信 息 会 给 真 菌生 物 学 带 来 光 明 的 前 景 。参 考 文 献 1 Cormack B. 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