皮尔瑞俄类芽胞杆菌BC39对番茄灰霉病的防治效果及防腐保鲜作用

第41卷 2014拄 第1期 2月 植物保护 学报 ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA Vo141 No1 Feb 2014 皮尔瑞俄类芽胞杆菌BC一39对番茄灰霉病的 防治效果及防腐保鲜作用 段军娜 黄 海 罗 晶 张 鑫 翟 枫 安德荣 (西北农林科技大学植物保护学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100) 摘要：为了探索拮抗菌株BC一39对番茄病害的控制作用，采用生长速率法、孢子萌发法测定了BC一 39发酵液冻干物对番茄灰霉菌的抑制作用，并研究了茵悬液对盆栽番茄灰霉病的防治效果及其对 番茄的防腐保鲜作用。经鉴定拮抗菌株BC39为皮尔瑞俄类芽胞杆菌Paenibacillus peoriae，其发酵 液冻干物抑制番茄灰霉菌茵丝生长和孢子萌发的EC分别为2172 mL和2346 gmL；10。 CFUmL BC39茵悬液对盆栽番茄灰霉病的保护和治疗效果分别为701和658，对采后番茄灰 霉病的防腐率为884，经l0。CFUmL茵悬液浸果处理后番茄的失重率为134，低于清水对照。 研究表明，皮尔瑞俄类芽胞杆菌BC39可作为生防制剂应用于番茄灰霉病的防治及番茄的采后保鲜。 关键词：皮尔瑞俄类芽胞杆菌；番茄灰霉病；采后病害；果实保鲜 The control efficacy of Peanibacillus peoriae BC-39 to tomato gray mold and its bioantisepsis-preservation on tomato fruits Duan Junna Huang Hai Luo Jing Zhang Xin Zhai Feng An Derong (State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas，CoHege of Plant Protection， Nohwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi Province，China) Abstract：In order to explore the control efficacy of an airborne antagonism bacterium BC一39 to tomato disease，the plate growth rate method and spore germination method were used for the inhibition of lyophilized broth of BC一39 on Botrytis cinema，and the control efficacy of BC-39 against to tomato gray mold was tested in pot experimentsThe antisepticise effect of BC-39 on tomato fruits was measured by artificial infection，and fruits were soaked in BC一39 bacterial suspension for the preservation of BC一39 on tomato fruitsThe strain was identified by analyzing biochemical characters and 16S rDNA gene sequencesThe results showed that this isolate was Paenibacillus peoriae，and the ECs0 of BC一39 lyophilized broth against mycelial growth and spore germination of pathogen were 2172gmL and 2346 pgmLrespectivelyThe protection and cure efficacy of 10。CFUmL BC一39 bacterial suspension to tomato gray mold in pot experiments were 701and 658，respectivelyThe control efficacy of 10。CFUmL BC一39 bacterial suspension to postharvest tomato gray mold was 884and the percentage of water loss of tomato fruits soaked in 10 CFUmL BC一39 bacterial suspension was 134，lower than the water contrastTherefore，Ppeoriae BC-39 could be a bioagent for control of tomato gray mold and for preserving tomatoes Key words：Paenibacillus peoriae；tomato gray mold；postharvest diseases；fruit freshkeeping 基金项目：高等学校学科创新引智计划(B07049)，国家“863”项目(2007AA021503) 作者简介：段军娜，女，1986年生，博士研究生，研究方向为微生物资源利用，E-mail：duanjunna_001126corn $通讯作者(Author for correspondence)，Email：anderong323163COB 收稿日期：20130602 62 植物保护学报 41卷 番茄灰霉病由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起，可 侵染番茄植株的叶、茎、花及果实，造成严重减产， 在我国北方保护地一般年份减产2040，流行 年份可达5070|l J。该病不仅在植株生长期 间发生，而且在采后的运输、储藏过程中还可继续 造成危害，在发达国家因该病引起的采后病果率达 1一20，在发展中国家病果率高达50 。种 植抗病品种是防治该病最经济有效的方法，目前已 有抗番茄灰霉病育种的报道 J，但尚处于实验室研 究阶段，因此，番茄灰霉病的防治和番茄采后保鲜 仍主要采用化学方法 J。灰霉病菌繁殖速度快、 遗传变异大、容易产生抗药性 J，且化学药剂污染 环境、危及人畜健康。随着人们对环境问题的13益 关注和对绿色食品的需求，微生物防治逐渐成为控 制番茄灰霉病和番茄防腐保鲜的一条重要途径。 皮尔瑞俄类芽胞杆菌PaenibaciUus peoriae发现 于1993年_7 J，其可分泌几丁质酶、蛋白酶等水解酶 类 ，对番茄灰霉菌、尖孢镰刀菌Fusarium oxyspo rum、顶青霉Penicillium corylophilum、禾生炭疽菌 Colletotrichum graminicola、黑曲霉Aspergillus niger等 多种植物病原真菌生长有抑制作用。Jeong等 叫报 道了皮尔瑞俄类芽胞杆菌KCTC 3763 可分泌十三 肽菌素、杀镰孢菌素、纤维素酶等拮抗物质，研究表 明该菌具有防治植物病害的潜力。但关于皮尔瑞 俄类芽胞杆菌对植物病害的防治国内外尚未见报 道，为此，本试验探讨了皮尔瑞俄类芽胞杆菌对番 茄灰霉病的防治效果及防腐保鲜作用，旨在为番茄 灰霉病的生物防治和番茄防腐保鲜制剂的开发提 供科学依据。 1材料与方法 11材料 番茄品种：金棚一号，西安金棚种苗有限公司 生产。 拮抗菌株：将接种灰葡萄孢的PDA平板(直径 9 am)开盖放置于室内，获得一株拮抗菌株BC39。 该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏号为CGMCC No5900。BC一 39的活化与保存采用LB培养基。 病原菌：棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f spvasinfectum、水稻稻瘟菌Pyricularia oryzae、小麦 赤霉菌Fusarium graminearum、苹果轮纹菌Macroph oma kawatsukai、梨黑星病菌Fusicladium pyrinum、辣 椒疫霉菌P ophthora capsici、苹果腐烂菌Valsa ma 、番茄早疫菌Ahernaria solani、番茄灰霉菌、胶孢炭 疽菌Colletotrichum gloeosporioides、小麦根腐菌 咖0一 laris sorokiniana、小麦全蚀菌Gaeummannomyces gra minis vartritici、棉花黄萎菌Verticillium dahliae、玉米 大斑病菌Exserohilum turcicum、烟草青枯病菌Ralsto一 、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus au reus、大肠杆菌Escherichia coli，均为本实验室保藏。 细菌培养采用LB培养基，真菌培养采用PDA培 养基。 药剂及仪器：10 CFUg多粘类芽胞杆菌Paeni bacillus polymyza可湿性粉剂(商品名：康蕾)，浙江 省桐庐汇丰生物化工有限公司生产。扫描电镜s 450，日本13立公司；透射电镜JEM一100CX I1，日本 电子公司。 培养基：TB培养基：将蛋白胨12 g、酵母提取物 24 g和甘油4 mL溶解到900 mL蒸馏水中，高压灭 菌。冷却到60，加入灭菌的磷酸缓冲液(017 molL KH2PO4、072molL K2HPO4)100mL，混匀。 12方法 121拮抗菌株鉴定 菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定 参照刘伟等_】的方法，菌体形态在扫描电镜和透射 电镜下观察。16S rDNA基因序列扩增和分析参照 冯志珍等_】 方法。提取细菌基因组DNA为模板， 以F27(5 一TACGGTACC ITGTrACGACT-3 )和R1492 (5 CTGAGCCAGGATCAAACT3 )为上、下游引物 扩增菌株的16S rDNA。PCR产物经1琼脂糖凝 胶电泳检测后送上海生工生物工程有限公司进行 序列测定，测序结果用BLAST和Clustal X软件在 GenBank数据库中进行同源性和多重序列比对，用 MEGA 50邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发 育树，并进行1000次Bootstraps检测。 122 BC-39对番茄灰霉病的防治作用 抑菌活性分析：平板对峙法测定拮抗菌株对病 原真菌的抑制作用。在PDA平板中央接种直径 6 mm病原菌菌饼，拮抗菌接种于距病原真菌3 cm 处，25下培养5 d后，测量抑菌带宽。滤纸片法测 定拮抗菌株对病原细菌的抑制作用。菌株发酵采 用LB培养基为种子发酵液，30条件下无振荡培 养18 h，按5的接种量接种到TB发酵培养基中， 30条件下无振荡培养48 h。12000 g离心10 rain， 上清液用022 m微滤膜过滤得无菌发酵液。在含 病原细菌的LB培养基中放置直径6 mm无菌滤纸 植物保护学报 4l卷 39与皮尔瑞俄类芽胞杆菌Ppeoriae同源性最近， 相似性为998。综合菌株的形态和生理生化特 征及16S rDNA序列分析结果，鉴定BC-39菌株为 皮尔瑞俄类芽胞杆菌Ppeoriae。 0005 图2邻接法构建的BC-39菌株系统进化树 Fig2 Neighbor_joining phylogenetic tree of strain BC一39 based on 16S rDNA sequence analysis 22 BC-39对番茄灰霉病的防治作用 皿内拮抗试验表明，BC39对所选的17种病原 菌均具有拮抗作用，且对病原真菌的抑制作用强， 对病原细菌的抑制作用弱，其中对番茄灰霉菌的抑 菌带宽为152 mm(表1)。 BC39发酵液冻干物对番茄灰霉菌的菌丝生长 和孢子萌发都有明显的抑制作用，EC 。分别为 2172 pgmL和2346 gmL。 表1 BC-39对指示菌的抑制作用 Table 1 Growth inhibition zones induced by BC一39 strain against indicator microorganisms 指示菌 抑菌带宽 指示菌 抑菌带宽 Pathogen Inhibition zone(mm) Pathogen Inhibition zone(mm) 棉花枯萎病菌 oxysporum 103033 胶孢炭疽菌Cgloeosporioides 90072 水稻稻瘟菌Poryzae 125057 小麦根腐菌Bsorokiniana 97054 小麦赤霉菌 graminearum 110062 小麦全蚀菌Ggramini vartrhici 143047 苹果轮纹菌M kawatsukai 130033 棉花黄萎菌 dahlia 150010 梨黑星病菌 pyrinum 103088 玉米大斑病菌Eturcicum 120071 辣椒疫霉菌Pcapsici 45021 烟草青枯病菌Rsoanacearum 100039 苹果腐烂菌 mali 59033 金黄色葡萄球菌Saureus 120102 番茄早疫菌Asolani 107078 大肠杆菌Ecoli 80062 番菌灰霉菌Bcinerea 152043 各数据均为3次重复的平均值标准差。Data are meanSD of 3 replicates 盆栽试验结果表明，在试验浓度范围内，BC-39 菌悬液对番茄灰霉病有明显防治效果(图3)，且随 浓度增加，防效也显著提高。BC-39菌悬液浓度为 10 CFUmL时，对番茄灰霉病的保护和治疗作用分 别为232和194；10 CFUmL时，分别为 527和486；10。CFUmL时，分别为701和 658。其中，浓度为10 CFUmL时，与对照药剂 均无显著性差异。 23 BC-39对番茄的防腐保鲜作用 231防腐作用 BC一39对番茄果实具有防腐作用，且随着菌悬 液浓度的增加，效果显著提高。菌悬液浓度为 10 CFUmL时，对采后番茄灰霉病的保护和治疗作 用分别为288和217；10 CFUmL时，分别为 547和506；10 CFUmL时，保护作用为 884，与对照药剂无显著性差异，但其治疗作用为 799，显著高于对照药剂(图4)。 232保鲜作用 与空白对照相比，BC39菌悬液对番茄果实具 有保鲜作用，随菌悬液浓度升高，番茄果实的失重率 降低。浓度为l0 、1O 、10。CFUmL时，失重率分 别为314、259、134，而空白对照失重率为 1期 段军娜等：皮尔瑞俄类芽胞杆菌Bc一39对番茄灰霉病的防治效果及防腐保鲜作用 萝 耄 鲁 毒 lO 10 10 CK 浓度Concentration(CFUmL) 图3 BC-39菌悬液对番茄灰霉病的盆栽防治效果 Fig3 The control efficacy of BC一39 to tomato gray mold in pot experiments 相同柱上不同字母表示经LSD方法检验在P005水平差异显著。CK：10 CFUg康蕾1 000倍液。Different letters in the same column indicate significant difference at P005 level by LSD testCK：10 CFUg Ppolymyza WP 1 000 萝 lO 10 10 CK 浓度Concentration(CFUmL) 图4 BC-39菌株对番茄采后灰霉病的防治效果 Fig4 The control efficacy of BC一39 to postharvest gray mold of tomato fruits 相同柱上的不同字母表示经LSD方法检验在P005水平差异显著。CK：10 CFUg康蕾1 000倍液。Different letters in the same column indicate significant difference at P005 level by LSD testCK：10 CFUg P polymyza WP 1 000 501，对照药剂的失重率为185，表明相同浓 度条件下，皮尔瑞俄类芽胞杆菌BC39菌悬液对番 茄的保鲜作用优于对照药剂。 3讨论 目前，筛选微生物资源主要集中在土壤 、海 洋m、植物根际 、植物体内 墙，但空气中也存在 着对人类有益的微生物。虽然空气中没有可供微 生物直接利用的营养物质和足够的水分，但能产生 各种休眠体的微生物，可随气流远距离传播，并在 空气中存在相当长的一段时间 ，这增加了在空气 中获得微生物的可能性。英国细菌学家弗莱明在 空气中发现可杀死葡萄球菌的青霉菌 。Rivas 等 在空气中获得一株产木聚糖的类芽胞杆菌。 本试验将含番茄灰霉菌的PDA平板暴露在空气中 获得一株拮抗番茄灰霉菌的皮尔瑞俄类芽胞杆菌。 番茄灰霉病是番茄生产中的重要病害，随着人 们环保意识逐渐提高，对无公害蔬菜的需求越来越 大，利用有益微生物控制番茄灰霉病的发生显得尤 为重要。目前，已报道的可防治番茄灰霉病的芽胞 杆菌有枯草芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌等 。本试 验中皿内拮抗试验和室内毒力测定表明，皮尔瑞俄 类芽胞杆菌BC39菌株可抑制番茄灰霉菌的菌丝生 长和分生孢子萌发，这是因为该菌可分泌水解酶 类 和脂肽类抗生素 。等拮抗物质；盆栽试验显 示，BC39菌株对番茄灰霉病有明显的防治效果，表 明其在番茄灰霉病的生物防治中具有潜在的利用 价值。 关于果蔬的微生物保鲜已有一些报道，如：蜡 样芽胞杆菌对苹果的保鲜作用 ，短短芽胞杆菌对 西瓜、苹果、梨、草莓的保鲜作用 J，枯草芽胞杆菌 对桃、草莓、樱桃、香蕉等的保鲜作用 等，说明应 如加如加m 0 踟加如如 m 0 植物保护学报 41卷 用微生物保鲜果蔬已成为研究热点。本试验结果 显示，BC39菌株对番茄具有防腐作用。根据张丽 霞等 和Poppe等 的报道，这一方面是因为拮 抗菌与病原菌竞争营养和空间位点，从而抑制病原 菌的生长；另一方面是BC一39菌株的代谢产物能够 抑制灰葡萄孢的生长。此外，本试验中BC-39菌株 在一定程度上有效防止了番茄果实水分的蒸发。 根据黄运红等 的报道，这可能是拮抗菌BC39在 番茄果实表面形成一层致密的膜而隔离空气，并延 缓了氧化作用。本试验只针对BC39菌悬液对番茄 灰霉病的防效进行了温室试验，今后还需对该菌的 抗菌物质进行研究，并通过大田试验等进一步探明 其生防机制。 参考文献(References) 1关天舒，朱茂山，李柏宏番茄灰霉病生物防治措施研究概 况辽宁农业科学，2009(1)：3941 2Sharma R R，Singh D，Singh RBiological control of posthar- vest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists：a reviewBiological Control，2009，50(3)：205221 3陈双臣，刘爱荣，邹志荣转葡聚糖酶和防御素基因的番茄 植株及其对番茄灰霉病的抗性植物保护学报，2006，33 (4)：357362 4纪军建，张小凤，王文桥，等番茄灰霉病防治研究进展 中国农学通报，2012，28(31)：109113 5车建美，郑雪芳，林抗美，等保鲜功能微生物对不同鲜切 水果保鲜效果的研究福建农业学报，2011，26(2)： 260264 6康立娟，张小风，王文桥，等灰霉菌的抗药性与适合度测 定农药学学报，2000，2(3)：3942 7Montefusco A，Nakamura L K，Labeda P DBacillus peoriae spnovInternational Journal of Systematic Bacteriology，1993， 43(2)：388390 8von der Weld I，Alviano D S，Santos A L S，et a1Antimicro bial activity of Paenibacillus peoriae strain NRRL BD-62 against a broad spectrum of phytopathogenic bacteria and fungiJournal of Applied Microbiology，2003，95(5)：11431151 9Lorentz R H，irtico S，da Silveira A B，et a1Evaluation of antimicrobial activity in Paenibacillus sppstrains isolated from natural environmentLetters in Applied Microbiology，2006， 43：541547 10Jcong H Y，Choi S K，Park S Y，et a1Draft genomc se quence of Paenibacillus peoriae strain KCTC 3763 Journal of Bacteriology，2012，194(5)：12371238 11刘伟，沈小英，段军娜，等抗烟草青枯病菌的芽胞杆菌 筛选和鉴定植物保护学报，2013，40(1)：9596 12冯志珍，陈太春，段军娜，等烟草黑胫病拮抗根际芽胞 杆菌FB一16的筛选鉴定及其抑菌活性植物保护学报， 2012，39(3)：224230 13中华人民共和国农业行业标准NYT 115610-2008农药 室内生物测定试验准则杀菌剂第1O部分：防治灰霉病试 验盆栽法2008 14习柳，田世平酵母拮抗菌与碳酸氢钠配合对番茄果实采 后病害的防治效果研究中国农业科学，2005，38(5)： 950955 15杨佐忠，叶建仁枯草芽孢杆菌PRS5菌剂控制水果贮藏 期病害的研究南京林业大学学报(自然科学版)，2006， 30(1)：8992 16薛鹏琦，刘芳，乔俊卿，等油菜菌