一株新的具有高效降低烟碱含量的短小芽孢杆菌MK21的分离筛选及作用研究

中国烟草学报2013年2月第l9卷第1期 生物技术 一株新的具有高效降低烟碱含量的短小芽孢杆菌 MK2 1的分离筛选及作用研究 陈德鑫 ，许家来 ，马志远 ，郭志刚4 安德荣。 1中国烟草总公司青州烟草研究所，山东省青岛崂山区科苑经四路1l号266101 2山东烟草研究院，山东省济南市新泺大街中段南侧250101； 3西北农林科技大学植物保护学院，陕西省杨凌示范区邰城路3号712100； 4陕西中烟工业有限责任公司，陕西省宝鸡市宝烟路1号720001 摘要：采用以烟碱作为唯一碳氮源的选择性培养基，对烟草表面的细菌进行选择性分离，建立降低烟碱含量菌库，通过富集初 筛复筛等试验后，从中筛选出一株具有高效降解烟碱能力的细菌MK21。根据形态学特征和生理生化反应及16SrDNA的鉴定， 鉴定其为短小芽孢杆菌。将该菌制成菌剂喷施于50 g烟丝样品上，发酵处理5 d。通过测定烟丝的总糖、还原糖、烟碱、氯、钾 含量。结果表明：处理后的烟丝中烟碱含量均有下降，其中最高的达到了26-3。通过短小芽孢杆菌MK21处理后的烟叶样品， 达到刺激性降低、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果。 关键词：烟叶；生物降解；短短芽孢杆菌；烟碱 Doi：103969issn10045708201301012 中图分类号：TS414 文献标识码：A 文章编号：1004-5708(2013)01-006005 Isolation and screening of a new Brevibacillus brevis strain MK21 with high nicotine degradation effect CHEN Dexin ，XU Jialai ，MA Zhiyuan ，GUO Zhigang ，AN Derong 1 Qingzhou Tobacco Research Institute，China National Tobacco Corporation，Qingdao，Shandong 266 1 0 1，China； 2 Shandong Tobacco Research Institute，Jinan 250101，China； 3 College ofPlant Protection，Northwest Agricultural and Forestry University，Yangling，Shanxi 712100，China； 4 China Tobacco Shaanxi Industrial CO，LTD，Baoji，Shanxi 720001，China Abstract：Study was carried out in order to provide a theoretical basis for research and application of reducing nicotine by microbia1Nicotine was chosen as the only selective medium of nitrogen sourceA series of bacteria which can decompose nicotine were found，and a strain coded MK2 1 was identifiedAccording to its morphology feature and physiological and biochemical characteristics and test on 1 6SrDNA，Breibacillus breis was identified Applying this bacteria on 50g samples of cut tobacco and then leave for fermentation for 5 days，Content of total sugar。reducing sugar，nicotine，chlorine and potassium were measuredResults showed that nicotine content in all samples declined as far as to 263Samples treated by MK2 1 with lower irritating chemicals can cover unp1easantness and improve taste Keywords：tobacco leaf；biodegradatiom Brevibacillus brevis；nicotine 基金项目 作者简介 通讯作者 收稿日期 国家“863特殊生物资源开发和利用项目”(2007AA021503)；陕西中烟公司生物发酵增香减害项目(2010182) 陈德鑫(1974一)，硕士，副研究员，研究方向为烟草病虫害防治，Tel：053266715507，Email：cdxycsgmailtom 安德荣(1963一)，博士，教授，研究方向为微生物资源利用，Emaih anderong323163com 20ll一0415 陈德鑫等 一株新的具有高效降低烟碱含量的短小芽孢杆菌MK21的分离筛选及作用研究 61 烟碱占烟草生物碱的95以上1-3，烟叶中烟碱 的含量与自然条件、农业技术措施、烟草类型、调 制方法等因素有关。近几年，利用微生物及其酶降 解烟草中的烟碱含量，已成为一种既可降低烟碱含量 又能改进卷烟品质的理想方法。目前研究表明，自然 界特别是在优质烟叶表面存在多种能有效降解烟碱 的微生物，如假单胞杆菌(Pseudomonasputid)、嗜烟 碱节杆菌 rthrobacter nicotinovorans)、氧化节杆菌 rthrobacter oxydans)等菌种 。 。 本研究从卷烟厂提供的国内外30余种醇化烟叶 样品表面分离得到了l0株降低烟碱含量细菌，进一 步筛选出一株具有降解高浓度烟碱的降解菌，并研究 了不同烟碱浓度下该菌株的降解能力和其在降低烟碱 含量发酵试验中的降解能力。旨在为降低烟叶烟碱含 量、提高烟叶可用性等方面提供依据。 1材料与方法 11试验材料 烟叶样品：云南昆明07C2F、陕西商洛07B4F-H2、 贵州遵义08C3F、湖北十堰B2F、津巴布韦01C07等， 均由陕西中烟公司提供。 烟碱(浓度 98)：C，。H N：由陕西天则生物 技术有限责任公司提供。 基础培养基：牛肉膏30g，蛋白胨l00g，NaC150g， 琼脂170 g，蒸馏水1000mL，pH 70。 富集培养基KHPO4 13 g，(NH4)SO4 1 g，KH2PO44g， 酵母粉1 g和烟碱1 g，蒸馏水1000mL，pH70。 液体发酵培养基：K HPO4 13 g，(NH )so4 1 g， KH2PO 4 g，酵母粉1 g和烟碱1 g，微量元素溶液 10 mL，蒸馏水1000 mL，pH 70。 微量元素：MgSO4 1 g，MnSO4 04 g，CaC12 02g， FeSO 02 g，用01 molL HC1定容至100 mL。 12降低烟碱含量细菌的分离与筛选 121 降低烟碱含量细菌的初步分离 将5 g烟叶样品加入到含有1 00 mL液体富集 培养基中，3O和220 rmin下摇床振荡培养48 h， 然后取100 u L上清液，加入900 12 L无菌水，摇 匀，即得10 倍的菌液；再取100 12 L 10。倍的菌液， 加900 12 L无菌水，摇匀得10 倍的菌液，稀释至 10增倍。吸取20 u L 10 和10培倍菌液，分别涂布 于分离培养基平板，在30。C条件下培养48 h挑选 单菌落进一步划线分离，重复操作，直到获得纯化 菌株。 122降低烟碱含量细菌的复筛 将得到的细菌分别接种到基础培养基上，培养 48 h后，用接种环接种于液体发酵培养基中，于30 和220 rmin下摇床培养48 h，取出，采用紫外分光光 度法测定烟碱含量。根据培养基中烟碱降低量的多少 来复选优良菌株。 12_3发酵液中烟碱的测定 以005 molLHC1为参比液，检测发酵液在236 nm， 259 nm282 nm处的吸光值，吸光值A为： A=A259一(A236+A282)2 对照烟碱的标准曲线和稀释倍数，计算发酵液中 烟碱的含量。 烟碱降解率公式为： 烟碱降解率= 型望里 纂 篆 。 124高效降低烟碱含量细菌的鉴定 在平板上观察菌落形态，并在电镜下观察菌株形 态，进行生理生化和16SrDNA的鉴定。 13降低烟碱含量细菌的功能研究 131 降低烟碱含量细菌菌剂的制备 将高效降解烟碱的菌株接种于100 mL的LB液 体培养基中，30培养24 h，得到种子液。将种子 液按10接种量转接到1L的LB液体培养基中， 30、150 rmin振荡培养24 h。培养液以4000 rmin 离心10 min，用无菌水洗涤沉淀，最后用20 mL无 菌水振荡均匀，使用时稀释10倍得到菌剂。 132烟丝发酵 将供试烟丝50 g喷施菌剂10 mL，对照喷施等 量无菌水。3次重复。然后将处理后的烟丝样品放入 25，60的恒温恒湿箱内发酵5 d，用于化学成分 的测定。 1-3-3烟样化学成分测定 将处理后的烟样送到陕西中烟工业公司技术中心 进行化学成分检测。 134感官评吸 将处理组和对照组的烟丝放入恒温恒湿箱中平衡 24 h后，制成卷烟，样品和对照均随机编号。由评吸 专家评吸。 2结果与分析 21降低烟碱含量细菌的筛选 经富集分离，筛选出10株降解烟碱效果较好的 细菌。观察菌落形态，结果如表1所示。 62 中国烟草学报2013年2月第19卷第1期 MJ1 MJ6 MJ23 MJ34 MJ15 MK10 MK5 MK12 MK14 MK2l 菌落形状不规则，淡黄色，边缘湿润 菌落有的呈脐状凸起，有的成纤维状，淡黄色，边缘呈现整齐透明，湿润 菌落纤维状，圆形突起，边缘透明，湿润，大小不等 菌落不规则，淡黄色，边缘整齐透明，菌落大，干燥 菌落圆形凸起，乳白色，边缘透明锯齿状 菌落形态不规则有凸起，乳白色，边缘整齐不透明，湿润，大小不等 菌落圆形凹陷，淡黄色，表面有褶皱，干燥 菌落圆形凸起，乳白色，边缘透明整齐，湿润，菌落相对较小 菌落表面不平整，乳白色淡黄色，边缘透明不规则，湿润，菌落相对较小 菌落表面不平整，淡灰色，边缘不规则透明，干燥 接种不同细菌后的液体培养基中的烟碱含量出现不同程度的变化，经过分析得到降解率，如表2。 表2液体培养基中不同细菌对烟碱的降解率 菌株OD 。烟碱降解率 菌株OD o。烟碱降解率 对照0 040 0 MK10 086 025 375 M儿O82 0-27 327 MK5 075 0_29 275 MJ6 085 026 356 MKl2 O89 O18 552 MJ23 091 013 674 MK14 073 O_32 201 MJ34 074 0_30 25O MK21 096 O06 85_3 MJ15 086 O28 3O0 烟碱含量在下降，发酵时间达到46 h后，烟碱含量 降低率超过了90。结果如图1。 暑 一 删 钿 罄 要 图1 MK21降低烟碱含量发酵试验 时间厂h 舱、 烟碱降解 冀 2 成 警 2 mLL杯 意分发萃 羔 茬口 。 量变化进行分析：发现随着时间的增长，发酵液中的 、， 。 里刚 帽圳 表3菌剂对烟样化学成分含量的影响 湖北 十堰 云南 曲靖 陕西 商洛 对照 2268 MK21 2432 对照 25o3 MK21 2549 对照 2678 MK2l 2701 7-23 A 184C 0859D 256A l_39 B 210A 281 207 3-31 267 361 321 26_3D 一193 C l11A 029 025 066 051 0-36 0_31 138A 一227B 139A 937 959 649 684 853 883 2_35 C 5_39 A 352B 引 卯 “ “ 陈德鑫等一株新的具有高效降低烟碱含量的短小芽孢杆菌MK21的分离筛选及作用研究 63 注：1变化率=【(处理含量一对照含量)对照含量100；2表中的数据为3次重复的平均值；3数据后大写字母不同表示在l水平 差异极显著。 23烟样的感官评吸 将菌剂MK21的处理组和对照组的烟样制成卷 烟，供卷烟专业评吸人员进行评吸。评吸结果表明经 过菌剂MK21处理的烟样，具有明显提高香气，降低 刺激性、掩盖杂气和改善口感的效果。如表4。 表4菌剂对感官评吸的影响 24高效降低烟碱含量菌株MK21的鉴定 241生理生化特性 通过群体菌落观察，该菌落特征均为不规则型， 边缘不整齐透明，为淡灰色，在液体中无菌膜，菌株 浑浊、无沉淀。降低烟碱含量细菌MK21生理生化特 性鉴定结果见表5。 表5菌株MK21的生理生化特征 将以上试验结果与常用细菌系统鉴定手册上 有关细菌的描述比较，结果表明菌株MK21的生理生 化特性与短芽孢杆菌属(Brevibacilles Shida)的特性 基本一致，因此，降低烟碱含量细菌MK21初步鉴定 结果为短芽孢杆菌属。 242 16S rDNA鉴定 利用Blast在GenBank数据库中进行同源性检索， 菌株MK21的16S rDNA序列与短短芽孢杆菌具有较 高的同源性(997)，并结合形态和生理生化特征， 图2透射电镜和扫描电镜下MK21菌落形态 中国烟草学报2013年2月第l9卷第1期 可确定该降低烟碱含量细菌为短小芽孢杆菌。 3结论与讨论 本研究通过选用特殊的选择性培养基，即烟碱 作为微生物生长所需的唯一的碳源和氮源，从醇化烟 叶表面分离筛选到一株高效降解烟碱的细菌，经过初 步鉴定为短小芽孢杆菌，命名为BrevibaciUes Shida MK21。将菌株制成菌剂后结合生物降解试验，处理 后的烟样烟碱、氯含量较对照烟样有所降低，且处理 后的烟叶香气质改善，香气量增加，烟叶内固有的刺 激性和杂气都有所降低。因此，喷施菌剂MK21对 烟叶的品质有明显的改善。 目前国内外报道的有降解烟碱功效的微生物主要 有：恶臭假单胞菌(Pseudananas putida)、氧化节 杆菌(Arthrobacter axidans)、纤维单胞菌(Cellulanonas sp)、嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicoti novorans)等， 而本研究中获得的MK21尚未在国内外报道中出现 类似降解烟碱的微生物。 在烟叶发酵过程中，微生物发挥着重要的作用。 目前的研究表明，在烟叶发酵过程中，微生物的生长 代谢所产生的许多次生代谢产物对烟叶的化学成分的 变化起着催化作用，促进大分子化合物转化和增香物 质的产生17-20。本实验中的短小芽孢杆菌MK21对烟 叶中的烟碱有明显的降低作用，但其在发酵过程中是 否会增加烟叶中的增香物质需要进一步的试验验证。 与此同时，微生物降解烟碱提高香气，改善烟叶品质 是多种因素共同作用的结果，其机理较为复杂，需要 进一步深入的研究。 参考文献 1】 王瑞新烟草化学MI北京：中国农业出版社，2003：65 84 2 周冀衡，朱小平，王彦亭，等烟草生理与生物化学M 合肥：中国科学技术大学出版社，1996：89124 3 徐宜民，王树声，赖禄祥，等烟草生物碱的研究现状J 中国烟草科学，2003(2)：1216 夏振远，雷丽萍，吴玉萍，等降低烟碱含量细菌一烟草 节杆菌K9的分离及鉴定J中国烟草科学，2006(2)：1-4 袁勇军，陆兆新，黄丽金，等烟碱降解细菌的分离、鉴 定及其降解性能的初步研究J微生物学，2005，45(2)：181 184 Wang S N，Xu P，Tang H Z，et a1Biodegradation and detoxification of nicotine in tobacco solid waste by a Pseudomonas spJ_Biotechnology Letters，2004，26：1493 1496 东秀珠，蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京：科 学出版社，2001 王广山，陈卫华，薛超群，等烟碱形成的相关 素分析 及降低烟碱技术措施J烟草科技，2001，(2)：38。42 李梅云，雷丽萍，郭荣君，等微生物对烤烟叶片烟碱含 量的影响J中国农学通报，2006，22(9)：9496 雷丽萍，夏振远，郭荣君，等降低烟碱含量细菌室内发 酵条件研究初报fJ西南农业学报，2006，19(4)：760763 李梅云烟碱的微生物降解研究进展fJ微生物学 志，2005，26(3)：9497 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