真菌多糖对黄瓜花叶病毒CMV的抑制作用

第卷第期年月西北农林科技大学学报 （自然科学版 ） （） 网络出版时间 ： ：网络出版地址 ：真菌多糖对黄瓜花叶病毒 （）的抑制作用收稿日期 基金项目 高等学校学科创新引智计划项目 （）；国家 “”计划 “特殊微生物资源的研究和利用 ”项目 （）作者简介 牛小义 （），男 ，河北石家庄人 ，在读硕士 ，主要从事微生物资源利用研究 。：通信作者 安德荣 （），男 ，陕西大荔人 ，教授 ，博士生导师 ，主要从事微生物资源利用及植物病理学研究 。：牛小义 ，李金岭 ，宋双 ，谢咸升 ，沈小英 ，安德荣（西北农林科技大学 植物保护学院 ，旱区作物逆境生物学国家重点实验室 ，陕西 杨凌）摘要 【目的 】筛选出对黄瓜花叶病毒 （）具有抑制作用的真菌多糖 。【方法 】采用半叶枯斑法和盆栽试验 ，测定了猴头菇多糖 、云芝多糖 、安络小皮伞多糖 、灰树花多糖 、灵芝多糖 、猪苓菌多糖 、黑木耳多糖 、虫草多糖 、香菇多糖和蜜环菌多糖等种真菌多糖对的室内抑制效果和对烟苗生长的影响 ；采用间接以及病情指数调查法 ，分别测定了云芝多糖对烟苗叶片内含量的影响及对的田间防效 。【结果 】不同质量浓度真菌多糖对均有一定的抑制作用 ，抑制效果随着多糖质量浓度的增加而提高 ，在不同处理中 ，真菌多糖对的预防效果最好 ，其次为钝化效果 。 的云芝多糖对具有良好的预防作用 ，防效高达；对烟苗的生长具有促进作用 ，烟苗株高 、茎围 、地上部鲜质量和最大叶面积分别比对照高，和。云芝多糖处理后 ，烟苗叶片内的含量处于较低水平 ，比对照含量低；田间药效试验显示 ，云芝多糖在较长的一段时间内对表现出较高的防效 ，在药后第，天防效分别达，和，防治效果显著优于对照药剂宁南霉素水剂和病毒。【结论 】云芝多糖对的防治效果良好 ，具有较好的研究应用价值 。关键词 云芝多糖 ；黄瓜花叶病毒 ；抑制作用 ；促生作用 ；田间防效中图分类号 文献标志码 文章编号 （） ， ， ， ， ， （ ， ， ， ，）：【】 （）【】 ， ，【】 ， ， （） ， ， ， ， ， ， ， 【】 ： ； 黄瓜花叶病毒 （ ，）是雀麦花叶病毒科 （）黄瓜花叶病毒属（）的典型成员 。是一种单股正链病毒 ，可侵染科属的 多种单 、双子叶植物 ，可经蚜虫和种子传播 ，是寄主范围最多 、分布最广 、最具经济危害性的植物病毒之一。病发病流行速度极快 ，可致作物生长发育停滞 ，严重影响农作物的产量和质量 ，造成严重的经济损失 。真菌多糖是各种真菌的子实体和菌丝体所产生的一类代谢产物 ，一般由个以上的单糖通过糖苷键连接而成 。真菌多糖在医学上应用广泛 ，相应的报道也很多 ，研究表明 ，真菌多糖通过抑制病毒吸附 、干扰病毒复制和提高机体免疫力等途径达到抑制人体病毒病的目的。随着真菌多糖在医学领域研究的不断深入 ，一些农业工作者从中得到启示 ，开始了真菌多糖在农业病害领域的应用和研究 。王杰等研究表明 ，食用菌多糖能够封闭病毒的侵染位点 ，抑制病毒在寄主中的增殖 ，并增强寄主抗性 。张超等研究表明 ，平菇多糖 、金针菇多糖和香菇多糖均对烟草花叶病毒 （）和具有显著的抑制效果 。吴艳兵等发现 ，毛头鬼伞多糖对具有较强的体外钝化和抑制侵染复制作用 ，可有效预防病毒病 。真菌多糖具有与葡萄糖激发子类似的抗病 、抑病活性 ，可诱导植株产生和积累植保素 、几丁质酶等抗病性物质，它不仅能够通过诱发植物抗性 、激发植物免疫力达到防治植物病毒病的目的 ，而且具有良好的环境兼容性 ，在病害防治方面具有良好的应用前景，。云芝 （ ）又称彩绒革盖菌 ，属于担子菌亚门 。云芝多糖是云芝提取物中的主要活性成分 ，相对分子质量在以上 ，是含有（）和（）糖苷键的葡聚糖。本研究测定了灰树花多糖 、云芝多糖 、灵芝多糖等种真菌多糖对的室内抑制作用及对烟草生长和烟苗中含量的影响 ，并进一步研究了其田间防效 ，以期筛选出对具有较好抑制活性的真菌多糖 ，为的生物防治提供理论和实践依据 。 材料与方法 材料 供试多糖猴头菇多糖 、云芝多糖 、安络小皮伞多糖 、灰树花多糖 、灵芝多糖 、猪苓菌多糖 、黑木耳多糖 、虫草多糖 、香菇多糖 、蜜环菌多糖等种多糖均由西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室提供 ，其多糖含量 （质量分数 ）分别为，和。 供试作物苋色藜 ，由西北农林科技大学植物保护学院病理实验室提供 ；普通烟，由陕西省烟草研究所提供 。 供试病毒黄瓜花叶病毒 ，由西北农林科技大学植物保护学院病理实验室提供 。 黄瓜花叶病毒粗提液的制备粗提液的制备采用二次聚乙二醇沉淀法。将供试病毒接种到烟叶上 ，在、自然光照条件下培养 ，后取感病叶片加抽提缓冲液 （柠檬酸缓冲液 ，含体积分数巯基乙醇 ），在组织捣碎机中捣碎 ，尼龙纱过滤后加氯仿至其体积分数为，振荡，置冰箱内，然后 离心，取上清液加入聚乙二醇（）至其体积分数为，并加至其质量浓度为，搅拌至完全溶化后 ，置冰箱内 ，后 ， 离心，取沉淀 ，用悬浮缓冲液 （重蒸水 ）悬浮过夜 ，然后 离心，取上清液 ，沉淀用悬浮缓冲液再洗一遍 ，合并次上清液 ，其总体积为原体积的。取上述上清液 ，加入至其体积分数为，并加至其质量浓度为沉淀 ，向沉淀中加入少量悬浮缓冲液过夜 ，然后 离心，所得上清液即为二次沉淀的病毒粗提液 。 试验方法 真菌多糖对的抑制效果真菌多糖对侵染的室内钝化 、预防和治疗作用的测定参考陈年春、逢丽丽等的方法 。（）真菌多糖对的钝化作用 。选取长势一致的苋色藜 ，将配制好的， 和 的种真菌多糖溶液分别与上述制备的病毒粗提液按的体积比混合 ，钝化后 ，用半叶法摩擦接种到苋色藜的左半叶 ，右半叶接种病毒粗提液作为对照 ，每个处理株 ，每株处理片叶 。将处理后的苋色藜在温室中培养 （、自然光照 ），后统西北农林科技大学学报 （自然科学版 ） 第卷计枯斑数 ，计算钝化效果 。（）真菌多糖对的预防作用 。选取长势一致的苋色藜 ，将配制好的， 和 的种真菌多糖溶液分别涂抹于苋色藜叶片左半叶 ，右半叶涂抹清水作为对照 ，时再涂抹次多糖 ，时全叶摩擦接种病毒粗提液 ，每个处理株 ，每株处理片叶 。将处理后的苋色藜在温室中培养 （、自然光照 ），后统计枯斑数 ，计算预防效果 。（）真菌多糖对的治疗作用 。选取长势一致的苋色藜 ，全叶摩擦接种病毒粗提液 ，待表现枯斑症状后 ，将配制好的， 和 的种真菌多糖溶液涂抹于苋色藜的左半叶 ，右半叶涂抹清水作为对照 ，每个处理株 ，每株处理片叶 。将处理后的苋色藜在温室中培养 （、自然光照 ），后统计枯斑数 ，计算治疗效果 。 真菌多糖对烟苗农艺性状的影响选择长势一致的叶期的烟草幼苗移栽至花盆中 ，缓苗后 ，分别叶面喷施， 和 的种真菌多糖溶液 ，每隔喷施次 ，共喷施次 ，并设清水对照 ，每处理盆 ，每盆株烟苗 。将处理后的烟苗在温室中培养 （、自然光照 ），个月后观察记录烟苗的生长情况 ，测量烟苗的株高 、茎围 、地上部鲜质量 、叶片数及最大叶面积 。 云芝多糖对烟苗叶片含量的影响用 云芝多糖溶液诱导处理叶期盆栽烟苗叶片 ，每株烟草喷上述云芝多糖溶液，以喷等量蒸馏水的处理为对照 。将处理后的烟苗放置于温度为、自然光照的温室中培养，接种病毒粗提液 ，从次日开始每天取株烟苗 ，每株取片叶 ，采用间接法检测诱导后烟苗叶片内的含量 （值 ），并连续检测。 云芝多糖对烟草的田间防效选择常 发 烟 田 作 为 试 验 地 ，供 试 药 剂 为 云芝多糖溶液 ，对照药剂为宁南霉素水剂和病毒，设空白对照 （清水 ）；每处理面积为，重复次 ，各处理随机排列 ；用背负式手动喷雾器进行叶面喷雾 ，喷雾量以叶面滴水为标准 ，首次喷药后进行第次喷药 。第次喷药后每调查次发病情况 ，共调查次 ，每处理随机点取样 ，每点调查株 ，共株 。以整株为单位调查发病情况 ，计算病情指数和防效 ：病情指数（各级病株数相对级数值 ）（调查总株数最高分级数 ），防效（对照病情指数处理病情指数 ）对照病情指数。 结果与分析 真菌多糖对的抑制效果从表可以看出 ，种真菌多糖对均有一定的抑制效果 ，其中云芝多糖 、灰树花多糖 、灵芝多糖和蜜环菌多糖的抑制效果较好 。真菌多糖对的抑制效果与其质量浓度以及处理方式 （钝化 、预防 、治疗 ）有关 ，其抑制效果随着多糖质量浓度的增大而提高 ，当多糖质量浓度为 和 时 ，云芝多糖的预防效果均较高 ，分 别 达和；其次为灰树花多糖 、灵芝多糖和蜜环菌多糖 ，预防效果依次为，和；真菌多糖的预防效果最好 ，其次是钝化效果 ，治疗效果较差 。总 体 来 看 ，不同质量浓度云芝多糖处理对的抑制效果有明显差异 ，其中 云芝多糖处理对抑制效果明显好于处理 ，而当其质量浓度增加到 时 ，抑制效果提高并不明显 （图）。表 不同真菌多糖对的抑制效果 真菌多糖 质量浓度 （）钝化效果 预防效果 治疗效果 云芝多糖 灰树花多糖 灵芝多糖 第期 牛小义 ，等 ：真菌多糖对黄瓜花叶病毒 （）的抑制作用续表 真菌多糖 质量浓度 （）钝化效果 预防效果 治疗效果 蜜环菌多糖 猴头菇多糖 黑木耳多糖 香菇多糖 安络小皮伞多糖 猪苓菌多糖 虫草多糖 注 ：同列数据后不同小写字母表示经氏新复极差法检验差异显著 （）。： （） 图 不同质量浓度云芝多糖对的抑制效果； ； 真菌多糖对烟苗农艺性状的影响由表可以看出 ，不同质量浓度的真菌多糖对烟苗生长均具有一定的促进作用 ，并且质量浓度越高 ，促进效果越明显 。 的云芝多糖 、灰树花多糖 、灵芝多糖和蜜环菌多糖处理后的烟苗健壮 ，叶片浓绿光滑 ，明显优于对照 ，其中以云芝多糖的效果最为明显 ，株高比对照高，茎围比对照增加了，地上部鲜质量比对照高，最大叶面积比对照高。表 不同真菌多糖处理对烟苗农艺性状的影响 真菌多糖 质量浓度 （）株高 茎围 地上部鲜质量 叶片数 最大叶面积 云芝多糖 灰树花多糖 灵芝多糖 蜜环菌多糖 西北农林科技大学学报 （自然科学版 ） 第卷续表 真菌多糖 质量浓度 （）株高 茎围 地上部鲜质量 叶片数 最大叶面积 猴头菇多糖 黑木耳多糖 香菇多糖 安络小皮伞多糖 猪苓菌多糖 虫草多糖 清水对照 注 ：表中数据为组重复的平均值 。： 云芝多糖对烟苗叶片含量的影响从图可以看出 ，云芝多糖处理后 ，烟草叶片内的病毒含量总体保持在一个较低的水平 ，比对照中含量低，而对照病毒含量逐渐升高 。图 云芝多糖诱导烟苗叶片含量的变化 云芝多糖对烟苗的田间防效从表可以看出 ，施用云芝多糖后 ，在较长的一段时间内对表现出较高的防效 ，在第，和天 ，云芝多糖对的防效分别达，和，防治效果显著优于对照药剂宁南霉素水剂和病毒。 讨论引起的植物病毒病是一种在世界范围内传播的病害，其发生遍及各烟区 ，危害严重 ，造成重大的经济损失 。目前 ，对的防治以化学防治为主 ，然而随着烟草可持续发展以及化学农药“”问题的日益严重 ，生物农药越来越受到重视 。作为天然生物物质 ，真菌多糖有着十分广泛的应用价值 ，不仅对植物病毒具有抑制活性 ，还可以诱发植物的抗病反应 ，因此可以作为植物生长调节剂和天然新型生物农药 。本试验结果表明 ，不同质量浓度的真菌多糖对均有一定的抑制作用 ，其抑制效果与多糖质量浓度及处理方式 （钝化 、预防 、治疗 ）有关 ，抑制效果随着真菌多糖质量浓度的增加而提高 ；在不同处理方式中 ，真菌多糖对的预防效果最好 ，其次为钝化效果 ，治疗效果较差 。 的云芝多糖对具有良好的预防作用 ，室内枯斑抑制试验和田间药效试验防效分别高达和；云芝多糖对烟苗的生长还具有促进作用 ， 云芝多糖处理烟苗株高 、茎围 、地上部鲜质 量 和 最 大 叶 面 积 比 对 照 分 别 高，和。云芝多糖的抗病毒机理可能是 ：（）云芝多糖能够直接与病毒在体外结合 ，降低了病毒对寄主的识别能力 ，导致其失第期 牛小义 ，等 ：真菌多糖对黄瓜花叶病毒 （）的抑制作用活 ；（）云芝多糖能够作用于寄主的病毒侵染接受点 ，使病毒失去和寄主细胞微伤口感受点结合的能力 ；（）云芝多糖可在一定程度上诱导烟草对的系统抗性 ，启动植物防御机制 ，达到抗病毒的目的 。表 云芝多糖对的田间药效试验结果 处理施药后第天 病情指数 防效 施药后第天 病情指数 防效 施药后第天 病情指数 防效 云芝多糖 宁南霉素水剂 病毒 空白对照 注 ：表中数据为组重复平均值 ；同列数据后标不同小写字母表示经氏新复极差法检验差异显著 （）。： ； （） 云芝多糖以其良好的抗活性 、促进作物生长 、提高植物抗病性 、以及对人畜 、环境高度安全等优良性能 ，符合当前农药发展的方向 ，具有良好的开发应用潜力 ，但其具体作用机制还有待进一步研究 。参考文献 徐平东 ，谢联辉黄瓜花叶病毒亚组研究进展 福建农业大学学报 ，（）： ， ，（）：（ ）郑子瑞 ，戴玲 ，钟辉多糖抗病毒活性的研究进展 生物技术通讯 ，（）： ， ， ，（）：（ ）王杰 ，王开运香菇多糖对植物真菌和病毒病害的抗病机理农药 ，（）： ， ，（）：（ ）张超 ，操海群 ，陈莉 ，等食用菌多糖对植物病毒抑制作用的初步研究 安徽农业大学学报 ，（）： ， ， ， ，（）：（ ）吴艳兵 ，谢荔岩 ，谢联辉 ，等毛头鬼伞多糖抗烟草花叶病毒（）活性研究初报 中国农学通报 ，（）： ， ， ， ，（）：（ ）王先彬 ，王启燕香菇培养物水溶液对烟草花叶病毒病 （）侵染心叶烟的抑制作用 微生物学报 ，（）： ， ，（）：（ ） ， ，（）：