土壤杆菌ATCC31749合成可德胶的研究进展

综述与专论 生物技术通报 BIoTECHNOL0GY BULLETIN 201 3年第3期 土壤杆菌ATCC31749合成可德胶的研究进展 余小琴吴毅歆何月秋毛自朝 (云南农业大学农学与生物技术学院，昆明650201) 摘要： 可德胶是一种具独特凝胶性质，由B一1，3-糖苷键连接的中性多糖。近年来随着食品、化工、医药等产业的发展， 对可德胶需求也逐年增长。土壤杆茵ATCC31749是可德胶合成的优良发酵菌。结合已测序的基因组精细图和蛋白组学研究，从可 德胶多糖合成的生物合成途径与能量代谢、信号转导及其调控机制等的研究进展来阐明可德胶发酵生产过程中产量形成的主要限 制因素，并据此提出更高效可德胶生产菌株改良及发酵生产条件优化的策略与手段。 关键词： 基因组精细图和蛋白组学可德胶生物合成调控机制 Research on Curdlan Synthesized by Agrobacterium sp ATCC31749 Yu Xiaoqin Wu Yixin He Yueqiu Mao Zichao (Agronomy and Biotechnology Institute，Yunnan Agriculture University，Kunming 650201) Abstract：Curdlan is a high molecular 13-1，3-glucan with unique gel natureCurdlan and itS modified molecule were used as new materials applied widely in industries of food，pharmaceutics and chemical engineering，resuhing in the growing of curdlan demand year by year Agrobacterium spATCC31749 is an efficient industrious strain for curdlan productionThis review summarized the advance of the fermentation and physiology of curdlan biosynthesis of the strainBy combining with ATCC3 1749 genomic information and proteomics study，we focus on signal transduction and regulation，energy producing and metabolic pathway of this special p0lysaccharides biosynthesis；then analyze the restriction factor for curlan synthesis and propose the strategies for how to improve the strain and optimize fermentation procedures Key words：Genomie information and proteomies Curdlan biosynthesis Regulatory mechanism 可德胶(Curdlan)是一种由D一葡萄糖以3-1，3 糖苷键线性连接而成的中性多糖 。可德胶溶液在 加热冷却后可以形成不同性质的胶体：加热60C可 以形成低固胶，加热到80C可以形成高固胶 。因 其独特的凝胶特性被广泛应用于农业、建筑及化工 行业等多个领域。如在食品、化妆品等加工过程作 为添加剂，其抗HIV、抗肿瘤、提高免疫力活性等 特性使其具有广阔的医用前景 J。目前全球可德 胶产品约有50亿美元的市场份额，并预计以每年 10左右的需求速度增长。 可德胶可由细菌、真菌和植物等生物体合成，商 用可德胶主要由农杆菌(Agrobacterium species)及其 收稿日期： 基金项目： 作者简介： 通讯作者： 衍生菌株发酵产生。土壤杆菌ATCC3 1 749(Agroba cterium spATCC3 1749)是一种革兰氏阴性细菌，菌 体形态呈杆状，是可德胶发酵生产及研究的优良模 式菌株 。土壤杆菌ATCC31749的可德胶代谢是 一个复杂的体系，外界环境对其基因的转录和蛋白 质的表达有直接影响。大量试验表明，微生物利用 糖质原料发酵时明显受到培养基中氮源条件的影响， 土壤杆菌ATCC31749必须在氮源耗尽的条件下才能 合成可德胶，而氮素充足时只进行的是正常的葡萄 糖代谢途径 ， 。但土壤杆菌ATCC31749的生长期 与产胶期是非偶联的，因此可以采用两阶段发酵的 方法提高产量。即第一步在正常氮源条件下增殖生 20120906 国家自然科学基金项目(31170057)，云南省自然科学基金项目(2010CD054)，国家科技型中小企业创新基金(11C26215305956) 余小琴，女，硕士研究生，研究方向：可德胶合成及其调控机理；E mail：14787884558163corn 毛自朝，男，教授，研究方向：生物化学与分子生物学；Email：mao2010zichao126corn 2叭3年第3期 余小琴等：土壤杆菌ATCC31749合成可德胶的研究进展 31 长，提高菌体浓度；第二步在氮源限制条件下促使 可德胶的合成 J。研究人员还发现控制pHll ，搅 拌速率影响的氧溶解速率 ，添加尿嘧啶_1 ，使 用多聚磷酸盐 等对可德胶合成有显著影响。本 研究总结前人的研究结果，结合ATCC31749的基因 组信息及蛋白组分析数据试图阐述可德胶生物合成 途径及调控机理，并据此探讨可德胶发酵工艺优化 和发酵菌株改良的可能途径。 1基于土壤杆菌ATCC31749基因组信息对 可德胶合成途径的分析 目前多个农杆菌菌株(包含ATCC31749)的基 因组的测序已基本完成。2001年根癌农杆菌(Agro bacterium tumefaciens str)C58序列信息和相关注释 的发表为土壤杆菌ATCC31749的基因信息研究提 供了重要参考 140 2011年，土壤杆菌ATCC31749 基因组信息正式发表 ，经blast分析，土壤杆 菌ATCC31749与根癌农杆菌C58序列相似度达到 95。在可德胶合成途径的研究方面，Stasinopoulos 等 通过转座子插入失活及功能互补分析，在土 壤杆菌ATCC31749的基因组中定位了2个可德胶 合成的基因座位，其中位置I是可德胶合成操纵 子，含有crdA、crdS和crdC 3个基因，位置II编 码一个潜在调控可德胶合成的蛋白crdR；2003年， Karnezis等 研究确定了crdS基因编码可德胶合 成酶的催化亚基，是可德胶合成的关键基因，利用 crdS蛋白及纤维素合成酶作内参进行同源聚类分析， 作出了，Fulvimarina pelagi HTCC2506，Agrobacterium spATCC3 1749，Agrobacterium tumefaciens(strain C58ATCC33970)，Rhizobium leguminosarum byviciae USDA 2370，Agrobacterium tumefaciens 5A，Agrobacte rium sp(strain H133)的系统发育树，显示可德胶 合成酶在土壤菌属关系较近，且与C58菌株具100 的同源性(图1 o lvimarina ATCC31749 C58 Rhizobium 5A H133 图1 crdS蛋白同源聚类分析 可德胶的合成需要低氮、低pH的环境因素诱导， 也需要三羧酸(TCA)循环提供物质和能量，在可 德胶合成期，TCA下游代谢受到抑制，脂多糖和脂 蛋白合成减少，而UDPG与UDP之间转化增强，并 消耗大量ATP，需要大量O 参与电子传递链来提供能 量 。通过序列blast比对和蛋白组学分析，在C58 中证实功能的关键基因可在ATCC31749中定位，如 表1所示。表1中所示前两部分基因为ATCC31749 可德胶代谢基本途径各酶的对应基因，其中第一部 分基因编码逆境条件下催化可德胶合成各步骤的酶 或因子，在可德胶合成期，其蛋白表达上调；第二 部分基因编码正常条件下糖类、脂类、蛋白质循环 代谢的各酶，在可德胶合成期，其蛋白表达下降_1 ； 第三部分为可德胶合成的调控基因；第四部分为电 子传递链中的关键基因。目前表中所示的基因已在 ATCC31749中找到精确的核酸和蛋白序列 ，ATP 等能量供应是影响可德胶产量的关键因素，其电子 传递链能量代谢情况值得深入研究。ATCC31749与 C58的基因组相似度极高(表1)，而目前C58尚未 有可德胶合成的报道，其原因或是C58缺少低氮等 逆境条件下的诱导，或是其合成与运输基因调控网 络中关键元件的缺失等，尚需进一步研究。 2可德胶合成信号转导及其调控途径分析 21 氮信号转导途径 细菌的氮素调控经典途径是NtrBNtrC双组件调 控系统，菌体可通过胞内信号分子0【酮戊二酸(2OG) 和谷氨酰胺(Gln)含量的比值变化来感知外界环 境中氮源的丰缺程度。当胞内2OG含量充足时，表 明外界环境中氮源受到限制，组氨酸激酶NtrB催化 应答调控蛋白NtrC磷酸化，使NtrC处于活化状态， 从而激活相关启动子和基因的转录，提高氮源利用 相关酶的表达量，并且影响可德胶和其他多糖的合 成，同时谷氨酰胺合成酶(GS)在腺苷转移酶(ATase) 的作用下脱酰苷而处于活化状态，催化谷氨酸合成 谷氨酸酰胺，进而在谷氨酸合成酶的作用下，催 化0【一酮戊二酸(2OG)与谷氨酰胺合成2分子谷氨 酸，并尽可能有效地从外界吸收氮源，形成铵态氮 后，转化为有机氮(主要是氨基酸和核苷酸)而快 速适应氮源限制环境；相反，当胞内Gin含量充足 时，表明外界环境氮源充足，NtrB调节磷酸酶活性 32 生物技术通报Biotechnology Bulletin 20l3年第3期 使NtrC脱磷酸化而处于失活状态，关闭氮源代谢相 关酶编码基因的转录和表达，此时菌体中GS被酰 苷化而失活 。ATCC3 1749中NtrBNtrC系统对氮 源的反应已在基因和蛋白质水平得到了验证，由蛋 白双向电泳结果表明有40种蛋白在NtrC突变体中 不能表达，但是葡萄糖磷酸变位酶的活性在NtrC突 变株中活性持续增长，在此条件下，此酶应是维持 菌株正常生长的代偿性增长；对于NtrB突变体，在 氮源限制时NtrC应急反应不能进行 。Kim等 发现创伤弧菌(Vibrio vulnifiells)胞外多糖的合成(包 括CPS和EPS)，受低氮条件下诱导，并受转录因子 NtrC与6因子(rpoN或其他)的调控，但Ruffing等 2o13年第3期 余小琴等：土壤杆菌ATCC31749合成可德胶的研究进展 33 发现，RpoN(6因子)敲出体中可德胶合成的增加 30，预示磷酸化的ntrC可能直接作为可德胶合成 相关基因的活化转录因子，而RpoN的突变降低了 RpoN对活性NtrC竞争结合，增强了可德胶合成代 谢途径基因的转录活化。 22 第二信使CdiGMP对可德胶合成的作用 环二鸟甘酸(cdiGMP)是1987年在研究木醋 杆菌(Acetobacter xylinum)中纤维素合成调控的过 程发现的，这种低分子量、高稳定的核苷酸信号分 子使木醋杆菌纤维素产量提高200倍 J。进一步 研究表明，cdiGMP是一种普遍存在的调控革兰氏 阴性细菌生物膜合成的第二信使，通常含有GGDEF 保守结构的合成酶(DGC)和含有EAL或HDGYP 保守结构蛋白的降解酶(腺苷二磷酸酶)来控制其 在细胞内的合成和分解 。ATCC31749基因组含 有31个含有GGDEF保守结构域的潜在鸟苷酸环化 酶(DGC)和十几个含EAL或HDGYP保守结构域 的磷酸二脂酶(PDE)基因，表明ATCC31749菌株 含有正常的cdiGMP及信号传导系统。Ruffing等通 过转录组分析发现，在限制氮源的培养条件下，有 3个GGDEF保守结构域的基因表达增高2倍以上， 将这3个基因敲出后，其中一个基因(AGRO一3967) 的敲出，相比对照，可德胶合成降低了1倍。我 在ATCC31749菌株中表达来源于大肠杆菌，能合 成cdiGMP的鸟苷酸环化酶(DGC)yddV基因和 降解cdiGMP磷酸二脂酶(PDE)yhjH，结果发现 vddV和yhjH的表达改变了ATCC31749菌株中cdi_ GMP的含量；在对pBQyddVATcc3 1749，pBQyhjH ATCC31749，pBQATCC31749(对照)3菌株进行 可德胶的发酵培养发现，经120 h的发酵培养后 pBQyddVATCC31749可德胶含量最高，pBQyhjH ATCC31749几乎检测不到可德胶的合成，而对照 pBQATCC3 1749的含量低于pBQyddVATCC3 1749 菌株(未发表数据)，而初步揭示了在ATCC31749 中可德胶的合成是受第二信使环鸟苷二磷酸(c GMP)正调控。 CdiGMP通过与效应蛋白受体(如讹p，pelD， vpsR和vpsT)或被调控基因的非编码的特异序列形 成的特殊二级结构(如核糖核酸分子开关，ribosw rich)相接合而诱发基因转录、蛋白质翻译及翻译后 修饰的信号网络传导过程，最终诱发与细菌运动、 致病性、生物膜(包括胞外多糖)合成相关的生理 代谢变化26-28。利用ATCC31749基因组信息进行 blast分析：peID未发现同源基因；FleQ，vpsR均与 ATCC31749中低氮信号感应与传递的转录因子NtrC 具55的同源性；而 sT则与其群体效应(quorum sensing)的转录因子LuxR基因高度同源。Nesper 等 报道了一个人工合成能从蛋白组中捕获cdi- GMP结合蛋白的分子(cdGCC)，该分子具有3个 功能基团，用其进行c diGMP结合蛋白的分离及质 谱测定是目前研究ATCC41749中cdiGMP调控可 德胶合成信号传递，特别是cdiGMP受体分子的有 效手段之一。 23 多聚磷酸盐、酸钙复合体、严紧反应相关的 信号途径 能量的供应是可德胶合成的重要限制因子，一 种潜在的能量源就是包括多个高能磷酸键的多聚磷 酸盐 ，在细胞内多聚磷酸盐在酸钙复合体中积 累，其水平受到胞外多磷酸酯酶(PPX)活性的影 响。多聚磷酸盐除了作为一种高能键的储备物外， 它的积累也是一种严紧应答反应。细胞内作严紧反 应信号，鸟苷五磷酸盐(pppGpp)和鸟苷四磷酸 盐(ppGpp)简称(P)ppGpp的积累能抑制胞外 多磷酸酯酶活性外，还能直接影响许多基因的转录 和翻译_3 。严紧反应信号(P)ppGpp的合成受氨 基酸饥饿的诱导，在限制氮素时，氨基酸合成降低 或停滞，而导致酮酸的积累进而降低胞内的pH值， pH为55时是可德胶合成的最佳条件，比其正常生 长的pH(70)要低很多。在此过程中rrpP基因(编 码一种膜相关的质子变位焦磷酸酶)可控制质子在 胞液和酸钙复合体间的转运从而调节pH，它在可德 胶合成期比菌体生长期表达下调了7倍；在可德胶 合成过程中，转录组分析及敲出试验表明严紧控制 信号基因relAspoT系统决定着能否产生可德胶，而 不仅仅是只调控其产量高低 引。研究还发现，在该 菌的培养基中加入三羧酸循环的代谢中间物(如柠 檬酸，苹果酸等)可刺激多糖合成 32，这与我们 的前期研究在低氮、低pH条件的培养基中加入柠 生物技术通报Biotechnology Bulletin 201 3年第3期 檬酸能增强野生型ATCC31749可德胶的产率(结果 未发表)相符合。柠檬酸在此反应中除作为三羧酸 循环的重要中间产物，还起到调节环境pH等作用。 因此多聚磷酸盐积累、酸钙复合体形成导致的pH 变化及细胞严紧反应因子的变化等相互交织，决定 着可德胶的合成及产量。 24 crdR的调控作用 crdR是可德胶合成的潜在调控基因 ，目前其 对可德胶合成的调控机理的研究还较少，试验表明 crdR的敲除使ATCC31749菌株丧失了可德胶多糖的 合成能力 。我们在ATCC31749中表达crdR，相 对于对照，可德胶合成增加35，半定量PCR初步 分析发现crdR表达后，无论在细胞增殖期还是在可 德胶的合成期，ATCC3 1749菌株crdS均呈上调表达 的趋势(未发表数据)。克隆后测序分析发现，crdR 与苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti，Strain 1021)转录因子phrR高度同源，并且苜蓿中华根瘤 菌中转录因子phrR的表达在pH62的条件下增强 了5倍 ，类比预示ATCC31749菌株中，酸性条 件刺激可德胶的合成可能受控于crdR的表达，目前 推测crdR与pH降低所引起的信号感应与转导有很 大关系。我们对可德胶多糖生物合成代谢网络的关 键基因编码的蛋白crdA，crdS，crdC和crdR中均存 在一些潜在的cdiGMP结合的位点，推测cdiGMP 在ATCC31749菌株中，可能在转录水平上首先与 crdR等转录因子相结合而诱导了包括crdA，crdS和 crdC等合成相关基因的表达，且cdiGMP进一步与 crdA，crdS和crdC相结合，激活关键合成酶系统， 但具体的调控可德胶的合成机制有待进一步的阐述。 3展望 综合以上分析，就可德胶发酵合成的整个代谢 过程而言，氮源限制、酸性环境、溶氧量及搅拌速 度等都密切影响着可德胶的合成。根据测序的土壤 杆菌ATCC31749基因组信息初步确定了可德胶的 合成途径和主要的调控基因及调控机理，但其信号 转导网络有待更多的研究和相关试验的证实。文献 中有一些有趣的问题引起了我们的注意：在可德胶 合成过程中，能量比底物的限制更具影响力，研究 者对发酵过程中UTP、ATP、ADP、AMP、NAD 、 NADH和UDPG等进行监测发现，即使UDPG的量 很高，但ATP水平不高时可德胶合成仍然很有限 ， 蛋白组学结果表明在可德胶合成量高时，ATP合成 酶和UTP合成酶表达都有较大增长。 。虽然现在 公认的可德胶合成是以UDPG为单糖载体，但ATP 在其中所起的作用是不可否认的，ATP可作为能量 物质也可能是单糖的结合载体。在可德胶合成后转 运途径中，PssAG可能参与了运输过程 ，但可德 胶从胞内运输到胞外的通道结构和调控机制也是将 来研究的热点。 为了提高大规模发酵生产中可德胶的效率，菌 株选育与优化是关键，虽然传统的诱变选育方法获 得良好的效果，但在基因组信息已知的前提下，代 谢工程手段改造是获得高产菌株是另一条重要途径。 提高热凝胶合成过程中葡萄糖转化为可德胶的代谢 流，增强菌体细胞呼吸链的整体效率以增强ATP的 生成能力，并结合普通的诱变与适应驯化应该是未 来菌株优化的首选方法。如通过表达Vhb基因增强 在可德胶合成过程中细胞内的氧分压 ，表达cdi_ GMP合成酶基因(如AGRD 967)增加胞内c di- GMP含量，表达pH调控相关的蛋白crdR等(见前 述)；通过ATCC31749基因组信息敲除如rpoN、部 分cdiGMP降解酶、多聚磷酸水解酶ppX1等基因 将是未来代谢工程改造和优化菌株的首选方法；增 强该菌株廉价碳源利用如纤维素、半纤维素利用能 力的酶类的表达，从而降低发酵成本；并且从工艺 上改进发酵设备，优化规模，提高分离纯化水平等 解决可德胶生产过程的限制因子，提高可德胶的产 量和质量。 参考文献 1Harada T，Masada M，Fujimori K，et a1Production of a firm resilient gelforming polysaccharide by a mutant of Alcaligenes faecalis var myxogenes 10C3JAgric Biol Chem，1966，30：196198 2Zhang HB，Nishinari K，Williams MAK，et a1A molecular description of the gelation mechanism of eurdlanJInt J Biol Macromol，2002，30：716 3Laroehe1 C，Michaud PNew developments and prospective appliea tionsfor B(1，3)glucnsJRecentPatBiotechnol，2007，1(1)： 5973 2013年第3期 余小琴等：土壤杆菌ATCC3 1749合成可德胶的研究进展 35 4Goodridge HS，Wolf AJ，Underhill DM-glucan recognition by the innate immune systemJImmunol Rev，2009，230：3850 5Lehtovaara BC，Gu FXPharmac0l0gical，structural，and drug delivery properties and applications of 1，3-t3一glucansJA c Food Chen，201 159(13)：68136828 6Karnezis T，Epa VC，Stone BA，et a1Topological characterization of an inner membrane(1 3)-13-Dglucan(eurdlan)synthase from Agrobacterium spstrain ATCC3 1749JGlycobiology， 2003，13(10)：693706 7Kim MK，Lee IY，Lee JH，et a1Residual phosphate concentration under nitrogenlimiting conditions regulates curdlan production in Agrobacterium speciesJJ Ind Microbiol Biotechnol，2000，25 180183 8Yu LJ，Wu JRChanges of curdlan biosynthesis and nitrogenous compounds utilization characterized in ntrC mutant ofAgrobacterium spATCC 31749JCurt Microbiol，2011，63：6067 9吴剑荣，詹晓北，刘惠，等氨水流加用于粪产碱杆菌热凝胶发 酵J生物工程学报，2008，24(6)：10351039 1OJin LH，Um HJ，Yin CJ，et a1Proteomic analysis of curdlan producing Agrobacterium spin response to pH downshiftJ Biotechrol，2008，138(3-4)：8O一87 11Zhang HT，Zhan XB，Zheng ZYImproved curdlan fermentation process based on optimization of dissolved oxygen combined with pH control and metabolic characterization of Agrobacterium sp ATCC 31749JAppl Microbiol Biotechnol，2012，93：367 379 12Lee JH，Lee IYOptimization of uracil addition for curdlan(B一1 3-glucan)production by Agrobacterium spJBiotechnnl Lett， 2001，23：11311134 13Yu U，wu JR Liu J，et a1Enhanced curdlan production in Agro bacterium spATCC 3 1749 by addition of low-polyphosphates l J j Biotechnology and Bioprocess Engineering，2011，16：3441 14Goodner B，Hinkle G，Gattung SGenome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58JJournal Science，2001，294(5550)：23232328 15Ruffing AM，CastroMelchor M，Hu WS，et a1Genome sequence of the curdlanproducing Agrobacterium spstrain ATCC 31749J Bacteriol，201 1，193(16)：42944295 16Stasinopoulos SJ，Fisher PR，Stone BA，et a1Detection of two loci involved in(1 3)一betaglucan(curdlan)biosynthesis by ATCC31749，and comparative sequence analysis of the putative curdlan synthase geneJGlycobiology，1999，9(1)：3141 17Karnezis T，Epa VC，Stone BA，et a1Topological characterization of an inner membrane(1 3)一betaDglucan(curdlan)synthase from Agrobacterium spstrain ATCC31749JGlycobiology， 2003，13(10)：693706 18Zhan XB，Lin CC，Zhang HT，et a1Recent advances in curdlan biosynthesis，biotechnologieal production，and applicationsJ Appl Microbiol Biotechnol，2012，93(2)：525531 1 19 J Zhang HT，Setubal JC，Zhan XB，et a1Component identification of electron transport chains in curdlanproducing Agrobacterium sp ATCC 31749 and its genomespecific prediction using comparative genome and phylogenetic trees analysisJInd Microbiol Bioteehnol，201 1，38：667677 20Dodsworth JA，Leigh JANitrogen regulation in bacteria and archaeaJAnnuRev Biochem，2007，61：349377 21Wu JRNtrCdependent regulatory network for eurdlan biosynthesis in response to nitrogen limitation in Agrobacterium spATCC 31749JProcess Biochemistry，201 1，9410：7-13 1 22 J Kim HS，Lee MA，Chun SJRole of NtrC in biofilm formation via controlling expression of the gene encoding an ADPglycero mannoheptose一6一epimerase in the pathogenic bacterium，Vibrio vulnificusJMolMicrobial，2007，63(2)：559574 23Ruffing AM，Chen RRTranscriptome profiling of a curdlan producing Agrobacterium reveals conserved regulatory mechanisms of exopolysaccharide biosynthesisJMicrobial Cell Factories， 2012，11(1)：113 24Ross P，Weinhouse H，Aloni Y，et a1Regulation of cellulose synthesis in Acetobacter xylinum by cyclic diguanylic acidJ Nature，1987，325(6101)：279281 25Schirmer T，Jenal UStructural and mechanistic determinants of cdiGMP signalingJNat Rev Microbiol，2009，7(10)：724 735 26Hickman JW，Harwood CSIdentification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a cdiGMPresponsive transcription factorJ Mol Microbiol，2008，69(2)：37689 27Kulshina N，Baird NJ，Ferr6DAmard ARRecognition of the bact erial second messenger cyclic diguanylate by its cognate riboswi tchJNat StructMolBiol，2009，16(12)：1212-1217 28Krasteva PV，Fong JC，Shikuma NJ，et a1Vibrio cholerae VpsT 36 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2013年第3期 regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic diGMPJScience，2010，327(5967)：866868 1 29Nesper J，Reinders A，Glatter T，et a1A novel capture compound for the identification