解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的生物防治

植物保护学报Journal of Plant Protection，2016，43(4)：588593 DOI：1013802jcnkizwbhxb201604009 解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的生物防治 曹晶晶 杨海艳 谢成升 田 佳 吴云锋 安德荣 (1西北农林科技大学植物保护学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100 2山西省农业科学院小麦研究所，临汾041000) 摘要：为探索新型生防菌剂解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的防治作用，通过盆栽和田间药效试 验研究了解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的防治效果和对小麦幼苗的促生长作用。结果表明，解 淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病有较好的预防效果和一定的治疗效果，浓度为5002 000 mgL时， 预防效果为24868455，治疗效果为13616258，预防效果明显优于治疗效果。其 中灌根处理的防治效果显著高于喷雾、拌种处理，且随着施用浓度的增大，防治效果提高；当灌根处 理浓度为2 000 mgL时效果最好，预防和治疗效果分别达到8455和6258。另外解淀粉芽胞 杆菌对小麦有一定的促生作用，并可提高麦苗的地上部鲜重，浓度为1 200 m#L时，地上部鲜重增 重最大，较对照提高5276。表明解淀粉芽胞杆菌可作为生防菌剂防治小麦黄花叶病。 关键词：解淀粉芽胞杆菌；小麦黄花叶病毒；防治效果 Control effect of Bacillus amyloliquefaciens on wheat yellow mosaic disease Cao Jingjing Yang Haiyan Xie Xiansheng Tian Jia Wu Yunfeng An Derong (1State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas，College of Plant Protection，Nohwest AF University，Yangling 712100，Shaanxi Province，China；2Wheat Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Linfen 041000，Shanxi Province，China) Abstract：To evaluate the control effect of Bacillus amyloliquefaciens on wheat yellow mosaic disease，the preventive and therapeutic effect on the disease and the growthpromoting effect on wheat seedlings were determined under laboratory and field conditionsThe results showed that the preventive effect of B amyloliquefaciens was better than therapeutic effect on wheat yellow mosaic disease compared to contro1 When the concentration of Bamyloliquefaciens ranged from 500 mgL to 2 000 mgL，the preventive effect was 2486一8455while the therapeutic effect was 1361一6258The control effect of root irrigation treatment was significantly higher than that of treatments by spraying or seed dressingThe control effect was enhanced as the dosage of application increased；the preventive and the therapeutic effects peaked at 8455and 6258，respectively，when bacteria were applied at 2 000 mgL by root irrigationBamyloliquefaciens also had a growthpromoting effect on wheat；the seedling flesh weight increased by 5276compared to the control when treated with 1 200 mgL of bacteriaIn conclusion，B amyloliquefaciens could be used as a bioagent to contro1 wheat yellow mosaic disease Key words：Bacillus amyloliquefaciens；Wheat yellow mosaic virus；control effect 小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus， WYMV)引起的小麦黄花叶病是一种土传病害，由习居 土壤的禾谷多黏菌Polymyxa graminis携带(王宏臣等， 2008)，借助于病土、病根残体、病田水流传播，也可经茎 基金项目：国家“863”计划(2012AA101504)，周家公益性行业(农业)科研专项(201203021)，国家自然科学基金(31471816) 通讯作者(Author for coespondence)，E-mail：anderong323163coln 收稿日期：20141217 4期 曹晶晶等：解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的生物防治 叶摩擦接种传播。该病主要分布于我国长江、黄河中 下游和淮河流域，其中江苏省里下河地区和宁镇扬丘 陵地区、山东半岛以及潍坊和临沂等地区、河南省信阳 及南阳和驻马店等地区、湖北省大别山地区、陕西省关 中地区发生严重(陈炯等，2000)。目前，该病害已成为 我国小麦生产上继小麦黄矮病之后的又一重要病毒 病。小麦感病后，一般可造成减产1030，重者减 产50以上甚至绝收(赵立尚等，2012)。 目前对小麦黄花叶病的防治以使用抗病品种和 化学防治为主，效果有限，并且小麦黄花叶病是一种 苗期病害，温度升高后病毒隐症，提高了其防治难度 (侯庆树等，1990)。随着可持续发展战略的需求以 及“3R”问题的日益严重，生物农药越来越受到重 视。1943年日本的Fukumoto在土壤中首次发现了 解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens(车晓曦和 李校望，2010)，因其产生能分解淀粉的液化淀粉酶 而命名。该菌是芽胞杆菌属中一种好氧产芽孢的革 兰氏阳性杆状细菌，具有代谢快、繁殖快、耐高温、安 全性高等特点。该菌对人畜无毒无害，不污染环境。 其代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的 抗逆能力，生长快，稳定性较好，很适合作为生防菌 大量生产和应用(关晓欢和姜华，2013)。 近年来大量学者对解淀粉芽胞杆菌在病害防治 方面进行了大量探索，且主要集中在真菌病害研究上 (王军华等，2006)。罗晶等(2013)研究结果显示，解 淀粉芽胞杆菌Ba一168对小麦全蚀病的防治效果显著 优于化学杀菌剂；张静等(2014)发现解淀粉芽胞杆菌 对山茶灰斑病菌有较好的抑制效果；黄海等(2o15)发 现解淀粉芽胞杆菌对番茄灰霉病有一定的防治作用； 申莉莉等(2OLO)观察到使用解淀粉芽胞杆菌Ba33对 5叶期三生烟Nicotiana tabacum varsamsum NN进行 喷施后再接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus， TMV)，能显著降低枯斑数量，并且其发酵液灌根处理 的烟苗鲜重、最大叶长和叶宽均高于清水对照处理， 且叶色浓绿，长势良好。而目前关于解淀粉芽胞杆菌 对于小麦病毒病的防治则鲜见报道。因此，本试验通 过盆栽和大田试验测定了解淀粉芽胞杆菌对小麦黄 花叶病的预防和治疗效果，明确解淀粉芽胞杆菌对小 麦幼苗生长的影响，旨在为小麦黄花叶病毒病的生物 防治提供科学依据。 1材料与方法 11材料 供试菌源及小麦品种：解淀粉芽胞杆菌菌株由 本实验室分离纯化得到(陈太春等，2011)；小麦黄 花叶病毒毒株及介体为田间采集和分离获得，由西 北农林科技大学植物保护学院病理实验室保存于防 虫温室中的普通小麦上。供试小麦品种为小偃22 号，由西北农林科技大学植物保护学院提供。 供试药剂：病毒特，即20盐酸吗啉胍乙酸铜 (moroxydine hydrochloride)可湿性粉剂，山东玉成生 化农药有限公司。 培养基：LB(LuriaBertani)培养基：酵母膏5 g、 蛋白胨10 g、NaC1 10 g、琼脂1520 g。马铃薯葡萄 糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂1520 g，水1 000 mL。 12方法 121解淀粉芽胞杆菌的盆栽防治效果测定 试验包括预防性试验和治疗性试验2部分。制 备WYMV接种液时，取1 g WYMV感病叶片，加少 量石英砂，于10 mL PBS溶液中研磨成匀浆，纱布过 滤，无菌水稀释至100 mL备用。预防性试验在解淀 粉芽胞杆菌和对照药剂病毒特处理后24 h汁液摩 擦接种wYMV，治疗性试验在各药剂处理前24 h汁 液摩擦接种wYMV。试验通过温室盆栽法进行，于 直径10 em塑料盆中点播小偃22号小麦种子，每盆 13粒，覆土后置于水盘中培养。试验设置3个处理 方式：喷雾、灌根、拌种，每处理设置4个解淀粉芽胞 杆菌浓度：500、1 000、1 500、2 000 mgL，各浓度设 置3次重复，即每种处理方式均为12盆小麦。拌种 处理是将小麦种子用75酒精表面消毒，清水冲洗 34次，用解淀粉芽胞杆菌拌均匀，晾干后点播；喷 施和灌根处理是于小麦3叶期施用解淀粉芽胞杆菌 3次，每次间隔3 d，以喷施病毒特和清水为对照。 122解淀粉芽胞杆菌的田间防治效果测定 试验在西北农林科技大学试验田进行。试验共 设置4个区组，分为3个试验组和1个清水对照组。 3个试验区组每区组设置6个小区，每个小区面积 为4 1TI3 111，小区之问设05 in保护行。播种小偃 22号小麦品种，行距02 1TI。播种前防治地下害虫 及杂草，排除对试验的干扰。 试验包括预防性试验和治疗性试验2部分，解淀 粉芽胞杆菌分为喷雾、灌根和拌种处理，每处理设4 个浓度：500、1 000、1 500、2 000 mgL。其中喷施和灌 根处理各进行3次，每次间隔5 d；其余处理方法同 121部分。小麦苗期每小区采用五点取样法取样， 每点20株小麦和40片小麦叶子(旗叶及倒二叶)，统 计小麦黄花叶病发病率、病隋指数和防治效果。病株 植物保护学报 43卷 率=发病小麦株数总调查小麦株数100；病情指 数=(各级病株数各级代表值)(调查总株 数最高级代表值)100；防治效果=(对照病情指 数一处理病情指数)对照病情指数100。 小麦黄花叶病的病情调查标准采用05级分级 法(刘伟华等，2004)：0级：植株无症状；1级：植株矮 缩不明显，轻度花叶，一般无明显的条纹坏死斑，叶片 不黄化或少数黄化；2级：植株矮缩不明显，轻度花 叶，产生明显的条纹坏死斑，叶片黄化明显；3级：植 株轻度矮缩，花叶明显，条纹坏死斑占叶面积12左 右，部分叶片黄化，少数枯死，分蘖黄化矮缩；4级：植 株明显矮缩，严重花叶，条纹斑占叶面积34左右，心 叶细弱扭曲或呈缩顶状，部分叶片和分蘖枯死；5级： 植株严重矮缩，多数叶片和分蘖或整株枯死。 123解淀粉芽胞杆菌对小麦生长的作用 选择同一批次播种的小偃22号小麦幼苗，设置 4个处理浓度为300、600、900、1 200 mgL的解淀粉 芽胞杆菌溶液，每处理1O盆，分别对小麦进行灌根， 每隔6 d灌根1次，共灌根5次，并设清水对照。将 处理后的小麦放置于2230 、自然光照的温室中 培养，观察记录麦苗的生长情况、叶片数，测量麦苗 的株高并称量地上部鲜重。 13数据分析 试验数据采用SPSS 160软件进行处理分析， 应用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。 2结果与分析 21解淀粉芽胞杆菌的盆栽防治效果 解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病具有显著的预 防效果和一定的治疗作用，同一处理的预防效果均 高于治疗效果，其中灌根处理的预防效果最好(表 1)。同一浓度下不同处理方式间预防、治疗效果也 有一定差异，解淀粉芽胞杆菌浓度为1 500、2 000 mgL时，灌根处理的预防效果分别为8137和 8455，显著高于喷雾处理的5954、6128和 拌种处理的5068、5291。当解淀粉芽胞杆菌 浓度为1 500、2 000 mgL时，灌根处理的治疗效果 分别为5924和6258，喷雾处理分别为 5359和5556，均显著优于对照药剂病毒特和 清水对照。 表1解解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的盆栽防治效果 Table l Effect of Bacillus amyloliquefaciens on wheat yellow mosaic disease in potgrowing plants 处理c。 c浓en度trati。n Treatment ( L；wJ- 预防作用Preventive effect 治疗作用Therapeutic effect 病株率() 病情指数 预防效果()病株率() 病情指数 治疗效果() Disease Disease Preventive Disease Disease Therapeutic incidence index effect incidence index effect 表中数据为平均数标准误。同列不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P喷雾拌种病毒特清水对照，同一处 理的盆栽试验效果优于大田试验，预防效果优于治 疗效果，且解淀粉芽胞杆菌的防治效果与其浓度、施 药方式(喷雾、灌根、拌种)以及处理方式(预防、治 疗)有关，其防治效果随浓度增大而提高，但不具正 比关系。表明解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的防 治以预防为主，兼具一定的治疗作用。解淀粉芽胞 杆菌不同浓度处理对小麦黄花叶病的防治效果有明 显差异，1 500 mgL处理明显高于500、1 000 mgL 处理，而当浓度增加到2 000 mgL时，防治效果提 高不明显。考虑到成本问题，田问应用时建议选择 解淀粉芽胞杆菌浓度为1 500 mgL。 表2解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的大田防治效果 Table 2 Effect of Bacillus amyloliquefaciens on wheat yellow mosaic disease in fieldgrowing plants 处理c。nc浓en度trati。n T m。“ (mgL) 预防作用Preventive effect 治疗作用Therapeutic effect 病株率() 病情指数 预防效果()病株率() 病情指数 治疗效果() Disease Disease Preventive Disease Disease Therapeutic incidence index effect incidence index effect 表中数据为平均数标准误。同列不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在Pn05水平差异显著。Data are meanSEDifferent letters in the same column indicate significant difference at Pn 05 level by Duncans new muhiple range test 23解淀粉芽胞杆菌对小麦的促生效应 不同浓度解淀粉芽胞杆菌对小麦幼苗的生长均 有一定促进作用，且浓度越高促生效果越明显(表 3)。与对照相比，解淀粉芽胞杆菌处理后的小麦幼 苗比较健壮，叶片浓绿光滑，明显优于对照。各浓度 处理组小麦幼苗的叶片数无显著差异，对株高和地 上部鲜重的促生效果显著，解淀粉芽胞杆菌浓度为 900 mgL时，株高较对照提高2156，地上部鲜重 较对照提高5232；增加至1 200 mgL时，株高较 对照提高2356，地上部鲜重较对照提高 5276，与900 mgL处理相比增加不明显，但均显 著高于对照。 3讨论 近年来小麦黄花叶病发生呈现的最大特点是暴 发性、间隙性。同时小麦品种抗病性具有病毒株系 的特异性，并且抗病性易丧失，这也增加了该病害发 生的突然性和化学防治的难度。另外，生产中新品 592 植物保护学报 t 43卷 表中数据为平均数标准误。同列不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P005水平差异显著。Data are meanSEDifferent letters in the same column indicate significant difference at P005 level by DuncanS new multiple range test 种的培育和推广常常忽略了对小麦黄花叶病的抗病 性评价，导致有些感病品种在病区大面积种植，促进 了该病害的蔓延和流行。小麦发生黄花叶病后，目 前尚无药物可以从根本上予以防治。王磊等 (2014)认为对于小麦黄花叶病的防治应以利用抗 病品种为基础，实施轮作换茬、适时播种、增施肥料 和土壤处理的综合防治措施，并且提出用2的戊 唑醇拌种，防治效果为5060；孙炳剑等 (2011)认为应主推抗病品种以减少小麦黄花叶病 的危害；王宏臣等(2008)提出了防治小麦黄花叶病 的综合防治举措；而本研究首次利用解淀粉芽胞杆 菌进行该病害的生物防治，结果表明，解淀粉芽胞杆 菌对小麦黄花叶病有较好的防治作用，效果与其浓 度、施药方式(喷雾、灌根、拌种)及处理方式(预防、 治疗)有关，且随着浓度的增加而提高；在不同处理 方式中，解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的预防效 果最好，高达8455，治疗效果相对较差。但随着 化学农药“3R”问题的日益严重，利用有益微生物解 淀粉芽胞杆菌防治小麦黄花叶病，能够缓解化学防 治中对生态环境带来的一系列问题，是一种环保、安 全、有效、可持续的植物病害防治手段，值得进一步 深入研究。 生物菌剂对小麦具有促生长作用。蔡磊等 (2001)报道了胨冻样芽胞杆菌Bmucilaginosus对 小麦苗期株高有明显促进作用；马桂珍等(201 1)研 究表明海洋细菌L 一9菌株对小麦株高、根长和单株 干重表现了良好的促进作用；林相璀等(2002)研究 表明生物菌剂BPM促进小麦鲜重增加399。本 试验结果表明解淀粉芽胞杆菌对小麦幼苗生长有明 显的促生、壮苗作用，地上部鲜重较对照提高 5232，高于其它同类试验。解淀粉芽胞杆菌作为 重要的生防资源，以其良好的防治效果、促生长作 用、提高植物抗病性等特性，有望成为具有开发前景 的新型植物病毒免疫抑制剂。 一些学者对解淀粉芽胞杆菌的作用机理进行了 研究，如段海明等(2014)和邓建良等(2010)发现解 淀粉芽胞杆菌在其自身的生长过程中可以产生60 多种抗菌物质和多种胞外酶；孙力军等(2008)从解 淀粉芽胞杆菌ES一2中，发现几大类具有抗细菌、真 菌、病毒和支原体功能以及良好的表面活性作用的 抗菌物质。本研究中解淀粉芽胞杆菌对小麦的预防 作用显著优于治疗作用，灌根处理显著优于喷雾和 拌种处理，其可能存在的机制是由于解淀粉芽胞杆 菌可分泌多种抗菌物质，并且其本身具有抗生、竞争 生长、营养和空间竞争作用，在植株表面和土壤巾快 速、大量繁衍和定殖，可能有效排斥、阻止和干扰了 病原微生物在植株表面的定殖与侵染。此外它还可 以激活植物体内多种防卫系统，植株就表现出抵御 病原物(真菌、细菌、病毒等)和一些有害生物侵染 等生理效应。解淀粉芽胞杆菌灌根效果最好，推测 其对小麦黄花叶病毒的传播介体禾谷多黏菌产生某 种作用，但有待进一步研究。 参考文献(References) Cai L，Li WP，Wu YY，Zhang KQ2011Promotion effect ofBacil lus mucilaginosus on the growth of wheat seedlingYunnan Ag- ricultural Science and Technology，(1)：1819(in Chinese) 蔡磊，李文鹏，吴颖运，张克勤2001胨冻样芽孢杆菌 对小麦苗期生长的促进作用云南农业科技，(1)：18 19 Che XX，Li XK2010The research on development of Bacillus amyloliquefaciensBeijing Agriculture，(3)：7一lO(in Chi nese)车晓曦，李校望2010解淀粉芽孢杆菌(Bacillu amyloliquefaciens)的研究进展北京农业，(3)：710 Chen J，Cheng Y，Chen JP2000Biological and molecular biologi cal characterization of wheat mosaic and wheat spindle streak mosaic bymovirusesVirologica Sinica，15(2)：97105(in Chinese)陈炯，程哗，陈剑平2000小麦黄花叶病毒和 小麦梭条斑花叶病毒的生物学和分子生物学研究中国病 毒学，l5(2)：97105 Chen TC，Lin XH，Li J，Gou LX，An DR2011Isolation，identi 4期 曹晶晶等：解淀粉芽胞杆菌对小麦黄花叶病的生物防治 593 fication of a bacterium isolate An-ctc-Y -1 and its antagonism for plant pathogenic fungusActa Agriculturae BorealiOccidentalis Sinica，20(7)：4145(in Chinese)陈太春，林星华，李 晶，苟丽霞，安德荣20111株Anctcy一1细菌分离物的 鉴定及其对植物病原真菌的作用西北农业学报，20(7)： 4145 Deng儿，Liu HY，Liu YX，Liu XT，Ni YX，Gao SX，Li GQ 2010Identification of the antifungal substances from Bacillus amyloliquefaciens strain YN1 Acta Phyt。path0logica Sinica， 40(2)：202209(in Chinese)邓建良，刘红彦，刘玉霞， 刘新涛，倪云霞，高素霞，李国庆2010解淀粉芽孢杆菌 YN一1抑制植物病原真菌活性物质鉴定植物病理学报，40 (2)：202209 Duan HM，Yu L，Wang B，Zhu ZQ，Liu L2014Study on the an tibaeterial effect of different fungicides to Bacillus cereusJour nal of Anhui Science and Technology University，28(3)：14 17(in Chinese)段海明，余利，王波，朱祖青，刘露 2014不同杀菌剂对蜡状芽孢杆菌的抑菌效果研究安徽 科技学院学报，28(3)：1417 Guan XH，Jiang H2013The research on development of Bacillus amyloliquefacieusBiotech World，(1)：4，9(in Chinese) 关晓欢，姜华2013解淀粉芽胞杆菌研究进展生物技 术世界，(1)：4，9 Hou Qs，Zhou YJ，Han H，Li ZZ，Wang LK，Fang NC，Sun LZ， Yu CLZhang儿1990Studies on a soil-borne viral disease of wheat in Jiangsu Province IITechniques of integrated con trol of wheat spindle streak mosaic diseaseJiangsu Journal of Agricultural Sciences，6(4)：3743(in Chinese)侯庆树， 周益军，韩红，李志正，王令坤，方南春，孙立洲，虞成龙， 张剑玲1990江苏省小麦土传病毒病的研究小麦梭条 花叶病综合防治技术及其依据江苏农业学报，6(4)： 3743 Huang H，Zhang X，Zou H，Yang HY，Cao JJ，An DR2015 Toxicity and control efficiency of fungicides against Botrytis cine teaJournal of Northwest A&F University f Natural Science E dition)，43(2)：184190(in Chinese)黄海，张鑫，邹 杭，杨海艳，曹晶晶，安德荣2015番茄灰霉病菌室内毒 力测定及药效试验西北农林科技大学学报(自然科学 版)，43(2)：184190 Lin XC，Wang SB，Yang YJ2002Control efficacy and growth yield effect of biological agents such as maceration spirit on wheat root diseaseShandong Agricultural Sciences，(4)：38 39(in Chinese)林相璀，王守波，杨永军2002消蚀灵 等生物制剂对小麦根部病害的防治效果及促长增产作用 山东农业科学，(4)：3839 Liu WH，He ZT，Geng B，Hou MS，Zhang M，Nie H，Han YP， Han CG，Wang JR，Yu儿，et a12004Identification of re sistance to yellow mosaic disease of wheat and analysis for its inheritance of some varietiesActa Phytopathologica Sinica，34 (6)：542547(in Chinese)刘伟华，何震天，耿波，侯明 生，张敏，聂桓，韩月澎，韩成贵，王锦荣，于嘉林，等 2004小麦对黄花叶病的抗性鉴定及典型品种的遗传分析 植物病理学报，34(6)：542547 Luo J，Zhang X，Huang H，Zhai F，An TC，An DR2013Control effect and mechanism of Bacillus amyloliquefaciens Ba一168 on wheat takeal1Journal of Plant Protection，40(5)：475476 (in Chinese)罗品，张鑫，黄海，翟枫，安天赐，安德荣 2013解淀粉芽胞杆菌Ba一168菌株对小麦全蚀病的防治及 其机制植物保护学报，40(5)：475476 Ma GZ，Wang SF，Bao ZH，wu SJ，Xia ZQ2011Control efficacy and growthpromoting ability of marine bacterium strain Ll-9 in wheatChinese Journal of Biological Control，27(2)：228 232(in Chinese)马桂珍，王淑芳，暴增海，吴少杰，夏振 强201 1海洋细菌L一9菌株对小麦的促生防病作用研究 中国生物防治学报，27(2)：228232 Shen LL，Wang FL，Qian YM，Yang JG2010Tobacco growth promotion effect and TMV resistance of Bacillus amyloliquefa ciens Ba33Journal of Jilin Agricultural University32(4)： 383386(in Chinese)申莉莉，王凤龙，钱玉梅，杨金广 2010解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草的促生及抗TMV作用 吉林农业大学学报，32(4)：383386 Sun BJ，Li HL，Yang XZ，Xie LH，Chen JP2011Evaluation of commercial wheat cultivars for resistance to Wheat yellow mosaic virus in HenanJournal of Plant Protection，38(2)：102108 (in Chinese)孙炳剑，李洪连，杨新志，谢联辉，陈剑平 201 1河南省主要推广品种对小麦黄花叶病毒抗性的评价 植物保护学报，38(2)：102108 Sun LJ，