胡继红下呼吸道感染细菌培养操作规范花脸稿解读

,Standard for Bacterial Culture Proceduresof Lower Respiratory Tract Infections,主要起草人：卫生部临床检验中心 胡继红,1, 大多数微生物室：40-60%/日 标本是否合格？ 定植菌？致病菌？ 生长不同种类细菌如何报告？ 生长不同数量细菌取舍？ 前后两天培养结果 培养结果与临床诊断,标本最多判断难报告难不符合,2,草绿色链球菌、奈瑟菌属嗜血杆菌属、莫拉菌属常见引起细菌性社区感染典型肺炎病原菌：,上呼吸道正常菌群, 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 金黄色葡萄球 卡他莫拉菌,肺炎支原体肺炎/鹦鹉热衣原体嗜肺军团菌柯克斯体（Q热）,痰的来源？是否被上呼吸道污染？细胞内病原引起非典型肺炎：,3,卫生部临床检验中心陕西省人民医院安徽省立医院卫生部北京医院北京大学人民医院中国医学科学院北京协和医院首都医科大学附属北京友谊医院解放军总医院浙江省温州医科大学附属第二医院,胡继红任健康马筱玲胡云建王辉徐英春苏建荣罗燕萍李向阳,4,1 美国微生物学会:临床微生物学操作手册（第3版）.2007.,（Clinical Microbiology Procedures Handbook）,2 美国微生物学会:下呼吸道感染临床微生物学检验技术及操作系列丛书.2004,3 叶应妩, 等.全国临床检验操作规程(第3版). 2006,4 美国微生物学会:临床微生物学手册(第10版).20115 美国微生物学会:临床微生物学手册(第9版).2006,6 Nagendra, S., P.Bourbeau, S.Brecher, M.Dunne, M.LaRocco, and G.Doern.2001.Samplingvariability in the microbiological evaluation of expectorated sputa and endotrachealaspirates. J. Clin. Microbiol.39:2344-2347.,7 Roson,B.,J.Carratala,R.verdaguer,J.Dorca,F.Manresa,and F.Gudiol.2000.Prospective study ofsputum Gram stain in the initial approach to community-acquired pneumonia requiringhospitalization.Clin.Infec.Dis.31:869-874.,8 Gleckman,R.,J.DeVita,D.Hibert,C.Pelletier,and R.Martin.1988.Sputum gram stain assessment,in community-acquired bacteremic pneumonia.J.Clin.Microbiol.26:846-849.,5,应用范围：针对医疗机构微生物实验室；, 检验项目：常规细菌培养检测下呼吸道感染病原菌； 操作流程：按分析前、分析中和分析后的顺序书写； 引言：是全篇的背景知识； 三个“规范性附录”：结果报告的重要依据。 内容 定性培养痰/气管吸出物； 定量培养支气管纤维镜采集标本； 快速排除和鉴别重要致病菌的方法； QC培养基和试剂的质量控制； 细菌培养报告需结合革兰染色涂片结果；报告的临床意义和格式内容。,6,（1）明确：下呼吸道标本 适合诊断的病原和检验项目 ；（ 2 ）规定：细菌培养项目需同时做革兰染色涂片（ 培养 + 药敏 + 涂片）；（ 3 ）规范：痰培养 / 气管吸出物的 定性培养 程序、气管镜采集标本的 定量培养 程序；（ 4 ）明确：报告 的临床意义和格式内容 。,分析前分析中,标本的采集、运送定性、定量培养、涂片流程,标本初筛、合格判断病原菌筛查和鉴定、质量控制,分析后,染色、培养结果报告（致病菌、非致病菌）、结果解释,7,8,1.2.3.,人类口咽部定植：需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌等微生物；菌群总数：1010 1012CFU/mL;健康人咽部定植菌特点：菌量最少；需氧的正常菌群组成：革兰阳性菌为主；影响因素：人体基础条件变化影响定植菌群的种类和数量；（微生态）,举例：长期接触携带定植菌人群菌群会变化，如日托儿童的父母的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌（具侵袭性）定植数量会增加；,基础条件变化：使用免疫抑制剂、慢性肺病、广谱抗菌药物治疗或住院患者等人群中，革兰阴性杆菌的优势明显增加。,9,常见因素：,住院患者（48h后）：,病毒感染抗菌药物损害侵入性仪器,继发细菌感染杀死、抑制正常菌群，使G-b、耐药菌过度繁殖，如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、阴沟肠杆菌等；定植菌：肠道菌，MRSA，多重耐药菌机械通气（ICU）嗜麦芽窄食单胞菌鲍曼不动杆菌,引起医院获得性感染,10,1）肺部感染的最常见机制：,肺泡内吸入了口咽部定植菌；, 吸入性肺炎患者咽部菌群种类： 多侵袭性细菌或耐药细菌，如肺炎链球菌或革兰阴性杆菌。, 清除机制：,健康宿主吸入口腔定植菌后常无临床症状，细菌,通常被粘液柱状纤维清除。 吸入能否引起肺部感染取决于： 吸入菌的致病性及数量；患者免疫系统；呼吸道功能等诸方面的因素。2）吸入气溶胶肺部感染占第二位： 主因：使用了不清洁的呼吸机。,3）血液播散性肺炎占第三位：,感染通常造成双肺下叶肺炎。由呼吸道感染引发的菌血症占12%，因此对肺部感染的高热患者送检血培养，有利于发现肺部感染的病原菌。,11,12,注1：肺炎链球菌和流感嗜血杆菌是引起儿童和老年人肺炎的最常见致病菌；卡他莫拉菌、脑膜炎球菌多发,于:,基础病患者或病毒感染后的继发感染；金黄色葡萄球菌肺炎可引发肺脓肿；肺炎克雷伯菌大叶性肺炎常合并脓肿或肺粘连，死亡率较高。,13,注2：通常可用分子生物学方法快速诊断，也可在感染后期用血清学方法检测肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌属抗体确诊。由生物恐怖病原菌，如和鼠疫耶尔森菌引起的感染，血清学检测可作为辅助诊断方法。结核分枝杆菌可用罗氏培养基或快速结核杆菌液体培养仪培养，或分子诊断方法检测。,注3：暴露在特殊气溶胶环境：与飞沫有关的结核分枝杆菌、与尘暴和鸟排泄物有关的双相真菌等。,14,除引起社区非典型肺炎的病原不能常规培养外，其他常见肺部感染的病原菌均可常规培养方法分离；但培养方法敏感性低，无法判断分离菌的来源。, 涂片革兰染色方法：,评价痰标本是否合格；提高病原菌诊断的特异性；涂片还可发现培养不能生长的细菌。涂片方法提高了培养方法的特异性及敏感性。,15,16,4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义,17,18,19,3.1 标本采集,3.1.1 咳痰,3.1.2 气管吸出物,注：仅当出现肺炎的临床表现（如发热或浸润）时采集气管吸出物标本，否则勿培养气管吸出物，因气管在插管 24h 后即有定植菌，培养结果,可能与疾病不符。,3.1.3 血培养,注：当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养,标本采集和送检要求）,3.1.4 诱导痰（通常不用于细菌培养）3.1.5 气管镜标本, 采集气管镜标本注意事项 支气管肺泡灌洗液标本(BAL) 保护毛刷(PSB),20,3.2 标本运送注 1 ：若送检标本超过 2h，将导致有临床意义的致病菌数量减少，非苛养的口咽部定植菌过度生长。为防止口咽部正常菌群的过度生长，可将标本放置 2 8 环境，但培养分离到肺炎链球菌等苛养菌的机会和数量会减少。注 2 ：若标本延迟送检超过 2h后未冷藏（超过 2h24h， 2 8 ），应在报告中说明因延误送检标本，可能对培养结果造成的影响。,3.3,筛选并拒收下呼吸道细菌培养标本,拒收24h内重复采集的痰细菌培养标本唾液鼻冲洗液和分泌物、鼻孔拭子咽部标本未经保护套管收集的支气管刷培养标本痰的厌氧菌培养标本,注：除支气管穿刺吸出物、 PSB 、活检标本、胸水或其他未经污染以外的标本做厌氧菌培养均不合格。,诱导痰,注：诱导痰标本只适用于检测卡氏肺孢子菌和结核分枝杆菌，对其他病原菌检出效果差。,21,4.1 痰及气管吸出物标本处理4.1.1 标本处理要求,接种标本及涂片操作必须在级生物安全柜中进行；应尽快处理所有标本，特别是来自急诊、新入院患者和有创方法采集的标本（如：BAL和肺活检标本），以保证致病菌的活性，避免造成重复采集标本；使用全自动接种前处理系统的实验室按厂家说明书处理标本，洗痰、液化后自动接种和涂片,革兰染色。4.1.2 接种标本4.1.3 培养4.1.4 标本涂片及革兰染色注 1 ：革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异。 1 ） 95% 乙醇脱色时间为 30s ； 2 ） 丙酮- 乙醇（体积比为 3:7, 棕色瓶室温保存，有效期 1 年）脱色时间 1s 5s ，脱色效果一致性好；3 ） 丙酮 （试剂纯）脱色时间最短，当标本中含大量宿主细胞时脱色效果好。注 2 ：使用革兰染色仪染色的实验室按照厂家操作说明书进行，注意条件优化，使涂片染色结果达到满意效果。4.1.5显微镜观察革兰染色结果,22,4.2 气管镜标本处理,..44.2.5,支气管肺泡灌洗液定量培养保护毛刷定量培养接种其他培养基并培养革兰染色标本处理剩余BAL标本可用于其他病原检测（标本珍贵）,对剩余BAL标本离心后，可根据需要进行病毒、分枝杆菌、军团菌和真菌培养；或做病毒、卡氏肺孢子菌、抗酸染色和真菌涂片染色 .4.3 连续培养并观察慢生长菌,23,适用于检测条件致病菌的所有项目,24,只用于诊断细菌性肺炎，定量培养和革兰染色,25,4.4 分离并鉴定下呼吸道重要致病菌（参见附录C）,“常见可疑菌落形态及经典快速鉴定方法(16种)”,4.4.1链球菌属,4.4.2苛养革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上难生长）4.4.3革兰阴性双球菌,4.4.4革兰阴性杆菌（在麦康凯平板上生长良好）4.4.5葡萄球菌属4.4.6肠球菌属,4.4.7革兰阳性杆菌4.4.8鉴定丝状真菌,4.4.9涂片时可见但培养不生长的细菌,26,27,4.5质量控制,4.5.1革兰染色4.5.2抗酸染色4.5.3培养基4.5.4试剂,每批号、每周需做质控的试剂,每批号、每次试验需做质控的试剂,28,5.1 革兰染色报告,5.1.1痰标本报告原则（见表1）,“痰 / 气管吸出物标本涂片革兰染色结果解释”,5.1.2 BAL细胞离心涂片报告5.2 报告有临床意义的微生物,5.2.1应报告的病原菌 （致病菌）,5.2.2培养和涂片相符合时报告的病原菌（与感染相关的定植菌）5.2.3有临床意义的数量,5.2.4报告有临床意义数量的非优势菌5.2.5报告有临床意义数量的优势菌,5.3 对非致病菌的报告,5.3.1报告“肠杆菌科细菌”5.3.2报告“非发酵细菌”,5.3.3只生长肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌5.3.4报告“分离到口咽部正常菌群”,5.4 平板上无细菌生长5.5 结果解释,29,不接受培养,可接受培养,提示感染,特征性,提示与感染相关的病原菌,注意！,30,用革兰染色来评估呼吸道标本是否合格,10鳞状上皮细胞/LPF标本来自上呼吸道,弹性纤维，中性粒细胞多，鳞状上皮细胞少，有代表性的好标本,31,你看见多少种形态？,几种细菌的混合形态，缺乏鳞状上皮细胞=混合厌氧菌感,染。如果是呼吸道标本可能是吸入性肺炎。报告临床医生“提示吸入性肺炎”,32,细胞内细菌,33,在使用抗生素之后链球菌常形态变得特别奇怪,34,呼吸道标本中未被染色的，,有折射的杆菌=抗酸杆菌,35,5.2.1 应报告的病原菌, 化脓链球菌, B群-溶血链球菌（儿童）, 博德特菌属，特别是支气管博德特菌 奴卡菌属, 新生隐球菌, 弗朗西斯土拉菌（高致病菌） 鼠疫耶尔森菌（高致病菌） 炭疽芽孢杆菌（高致病菌） 丝状真菌（排除腐生菌污染）,36,处理培养物应参考涂片的结果，应根据革兰染色所见炎症细胞和细菌的形态与培养物进行对照，当培养与涂片结果不相符时应重新读片。,当培养生长的细菌在涂片中亦和炎症细胞相关时，报告以下两种病原菌：肺炎链球菌，并报告药敏结果流感嗜血杆菌，常规报告-内酰胺酶,37,下呼吸道标本有意义的细菌浓度值（CFU/ml）,标本自然咳痰诱导痰气管内吸取物支气管肺泡灌洗液保护性毛刷支气管灌洗液,有意义的浓度 CFU/ml107不确定106104103不做培养,38,a. 定性培养生长的病原菌数量达到以下情况时，判断为有临床意义：,在平板第2区划线仍大量生长，或培养物生长量超过1/4平板；培养少量生长且革兰染色涂片可见此形态细菌与炎症细胞相关联的病原菌；在平板划线第1区生长且纯度超过90%以上时，同时革兰染色,涂片可见此形态细菌与炎症细胞相关的病原菌。b. 定量培养有临床意义的数量： BAL：菌落计数 104 CFU/mL PSB：菌落计数 103 CFU/mL 取最高稀释度平板，分别对不同菌落形态的细菌计数，乘上稀释倍数即为菌落数。,39,当培养达到5.2.3所示有临床意义的数量时，即,使非优势菌也应报告的病原菌：,a.卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌，常规报告-内酰胺酶；b.只对住院患者报告的病原菌有：, 铜绿假单胞菌，并报告药敏结果, 嗜麦芽窄食单胞菌，并报告药敏结果, 不动杆菌属，特别是鲍曼不动杆菌，并报告药敏结果 洋葱伯克霍德菌，并报告药敏结果,40,生长菌达有临床意义数量的优势菌，特别当涂片提示分离菌与,多形核白细胞相关时报告的病原菌：,a. 金黄色葡萄球菌，并报告药敏结果,b. B群-溶血链球菌（成人）、C群或G群-溶血链球菌,c. 单一形态革兰阴性杆菌（特别是肺炎克雷伯菌），并报告药敏结果d. 苛养的革兰阴性杆菌，通常报告-内酰胺酶e. 脲酶阳性的棒状杆菌或来自ICU的患者f. 分离自免疫抑制患者的马红球菌,41,5.3.1报告“肠杆菌科细菌”,在麦康凯平板上生长 1种 G-b，经氧化酶(-)、乳,糖产酸等试验初步鉴定为肠杆菌科细菌，报告：,经鉴定生长“肠杆菌科细菌”。,5.3.2报告“非发酵细菌”,在麦康凯平板上生长 1种 G-b，经氧化酶(+)、,克氏双糖铁上不发酵葡萄糖等试验初步鉴定，报告：,经鉴定生长“非发酵细菌”。,42,若只生