碳氮源影响红曲霉代谢合成GABA的研究

本 科毕业论文（设计）碳氮源影响红曲霉代谢合成 GABA 的研究学 院： 生命科学学院 专 业： 生物技术 班 级： 111 班 学 号： 1107040067 学生姓名： 符东顺 指导教师： 董 旋 2015 年 6 月 1 日贵州大学本科毕业论文（设计） 目 录摘 要 .VAbstract.VI1 前 言 .11.1 GABA 概述 .11.1.1 GABA 的结构及理化性质 .11.1.2 GABA 的生物合成机理 .21.2 GABA 的生理功能 .21.2.1 预防高血压 .21.2.2 抗衰老 .31.2.3 调节激素分泌 .31.2.4 预防肥胖 .31.2.5 缓解酒醉症状 .31.2.6 调节心率失常 .31.2.7 治疗癫痫 .31.3 GABA 的生产 .41.3.1 化学合成法 .41.3.2 植物组织代谢 .41.3.3 微生物发酵法 .41.4 碳氮源在真菌生长发育中的作用 .51.4.1 碳源对真菌生长发育中的影响 .51.4.2 氮源对真菌生长发育中的影响 .51.5 本项研究的目的、意义和内容 .61.5.1 研究目的、意义 .61.5.2 研究内容 .61.6 本项目技术路线 .7贵州大学本科毕业论文（设计） 2 材料与方法 .92.1 实验材料 .92.1.2 培养基 .92.1.3 主要试剂 .92.1.4 主要实验仪器 .102.2 实验方法 .102.2.1 红曲霉菌种复壮 .102.2.2 菌种的活化 .102.2.3 培养方法 .102.2.5 碳源对 GABA 合成的影响 .112.2.6 氮源对 GABA 合成的影响 .122.2.7 培养基碳氮源正交实验 .122.2.8 数据整理与分析 .123 结果与分析 .133.1 标准曲线绘制 .133.2 氮源对 GABA 合成的影响 .133.4 碳源对 GABA 合成的影响 .143.5 正交实验结果 .153.6 小结 .19参考文献 .20致 谢 .22附录 .23贵州大学本科毕业论文（设计） 碳氮源影响红曲霉代谢合成 GABA 的研究摘 要-氨基丁酸(-aminobutyric acid，GABA)作为哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质越来越受到关注。红曲霉作为中国历史悠久的药食两用真菌，其重要的次生代谢产物之一就是 GABA。目前红曲霉的发酵工艺的研究很活跃，通过培养条件的优化提高 GABA 的产量是众研究者们追求的目标。本论文根据 GABA 代谢途径选择不同的碳氮源因子，分别进行单因素轮换实验考察对生物合成 GABA 有影响的碳氮源因子，并对实验结果有显著影响的碳氮源因子设计五因素四水平的正交实验对其进行优化，最后实验确定较优的碳氮源组合为：谷氨酸钠1%；谷氨酸 1.25%；甘氨酸 1.5%；葡萄糖 2%；麦芽糖 2.5%，在最优条件下做验证试验后，GABA 的产量可达到 5.778mg/g。为促进 GABA 的高效合成提供一定的参考价值。关键词：红曲霉 GABA 碳氮源 优化贵州大学本科毕业论文（设计） The Influences of Nitrogen and Carbon Sources on the GABA synthesized by MonascusAbstract-aminobutyric acid (-aminobutyric acid, GABA) is an important inhibitory neurotransmitter in the mammalian central nervous system ,so researches about it is increasingly.Monascus is a historic medicinal and edible fungi in China,one of its important secondary metabolites is GABA. In recent years research about Monascus fermentation process is very active, raise the production of GABA by optimizing conditions of fermentation process are all researchers wanted to be. In this paper,According to the different metabolic pathways of GABA ,We selected the factor of carbon and nitrogen sources,According to the single factor experiment,Find out the most effecting carbon and nitrogen sources which can promote the Synthetic metabolic of GABA.And selected carbon and nitrogen factors which have significant impact on the result. design the five factors and four levels orthogonal experiment to optimize the fermentation process.finally found the optimum combination of carbon and nitrogen sources are: sodium glutamate 1%; glutamate 1.25%; glycine 1.5%; 2% glucose; maltose 2.5%, in optimal conditions after verification tests, GABA production could reach 5.778mg/g. Provide certain reference value to promote efficient synthesis of GABA.Key words:Monascus GABA Carbon and nitrogen sources Optimization贵州大学本科毕业论文（设计） 第 0 页1 前 言-氨基丁酸(-aminobutyric acid，GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质。具有降低血压、抗焦虑和抑郁、改善睡眠、提高记忆力等生理作用。2009 年，GABA 称为中国卫生部批准的新资源食品，天然 GABA 已被利用到乳制品、软饮料、和酒饮料中 27。GABA 的合成方式主要有化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。但是化学合成的反应过于激烈和有安全隐患，天然植物中提取 GABA 受到资源和环境的限制，而微生物发酵提取 GABA 具有成本低、无化学残留、产量高等优点，是生产GABA 的理想途径。微生物发酵方式分为液态发酵和固态发酵，早期投入 GABA 生产的主要是大肠杆菌，使用乳酸菌、曲霉菌、酵母菌等微生物也能够发酵制备。红曲霉作为中国历史悠久的药食两用真菌，其重要的次生代谢产物之一就是 GABA10。微生物的生长和代谢产物的累积一方面受到菌种差异本身的影响，另一方面受到营养和环境条件的限制，其生物合成路径、代谢产物种类及其产量与培养基组成成分、发酵条件等环境因素有紧密的联系。为了提高产量，有必要了解生产菌生长代谢所需的最佳条件。碳源和氮源为微生物提供最基本的营养成分，对微生物的生长和代谢有着重要的作用。本论文根据 GABA 代谢途径选择不同的碳源、氮源因子，各进行单因素轮换实验考察对生物合成 GABA 有影响的碳氮源因子，并对实验结果有显著影响的碳氮源因子设计正交实验对其进行优化，确定较优的碳氮源组合，为促进 GABA 的高效合成提供一定的参考价值。1.1 GABA 概述1.1.1 GABA 的结构及理化性质-氨基丁酸(-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质构成的天然氨基酸，以自由态的形式普遍存在于原核生物和真核生物中，由谷氨酸(Glutamic-acid，Glu)经谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)催化转化而来。纯的 GABA 在常温下为白色结晶体或结晶状粉末，微臭，无旋光性，吸湿性强，易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、乙醚和苯，为极性物质。从乙醇中结晶可以得到棱柱体。结晶产物不易吸收水分，尽管在高温环境下也不会结块，但在真空环境贵州大学本科毕业论文（设计） 第 1 页下易升华。熔点 202204，熔化后分解成吡咯烷酮和水。1.1.2 GABA 的生物合成机理在细菌和哺乳动物大脑中，GABA 先在 GABA 转氨酶(7-Aminobutyrate transaminase)的催化下，和 -酮戊二酸产生转氨作用构成琥珀酸半醛(SSA)和 Glu，然后 SSA 在琥珀酸半醛脱氢酶(succinate semialehyde-dehydrogenase，简称 SSADH)氧化形成琥珀酸进入三羧酸循环，这些反应和 GAD 催化的 Glu 脱羧反应一起，形成了-酮戊二酸氧化成琥珀酸的另外一条支路，称之为 GABA 支路。图 1.1 GABA 代谢合成图经学者多年的研究发现，植物有两种方法来合成 GABA：一是由谷氨酸脱羧酶催化的 GABA 支路；另外是由多胺降解的，多胺降解也可转化为 GABA。腐胺经二胺氧化酶催化，可形成吡咯啉、过氧化氢和氨；在多胺氧化酶的作用下，亚精胺和精氨分别氧化成吡咯啉、1-（3- 丙氨基） 2-吡咯啉以及二氨基丙烷和过氧化氢，吡咯啉又可在吡咯啉脱氢酶的催化下构成 GABA。1.2 GABA 的生理功能在哺乳动物体内，GABA 是中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质，它通过存在于神经突触后膜的 三种受体，即 GABAA，GABA B和 GABAC及与其它神经递质的交互作用，参与了各类动物体内重要的行动和生理反应的调节。因此，将 GABA 应用于功能性食品、医药品是很有发展前景的。1.2.1 预防高血压 GABA 能促进脑部血液循环、促进氧供应，脑细胞功能亢进。高血压是现代中国的老年人常见的疾病，估计我国高血压患者超出 1 亿。现在，临床上常常使用 GABA 来改善脑血栓后遗症、脑动脉硬化症等造成的头疼以及耳鸣、抑郁症等疾病。使用 GABA 还可贵州大学本科毕业论文（设计） 第 2 页以使血管扩张，降低血压 28。高血压患者常因肾功能不强，不能使多余的盐分从尿中排出，GABA 可以活化肾功能，然后激活利尿作用将多余的盐分从尿中排出，使血压降低，预防高血压。 1.2.2 抗衰老 红曲萃取物中含有高活性的 SOD 类似物，具有极优良的抗氧化力。研究发现缺乏GABA 可能是脑老化的原因，中国科学技术大学等研究人员对老年恒河短尾猴进行研究后发现：GABA 能促使大脑处于活跃状态。随着动物年龄的增长，大脑中 GABA 含量会越来越少，短尾猴的视觉功能会随年龄的增大而衰退，将 GABA 注入老龄短尾猴体内后，它们的视力有明显好转，此研究证明 GABA 能帮助神经细胞处于对信号的高识别能力状态 27。 1.2.3 调节激素分泌 GABA 作为抑制性神经递质，可参与调节垂体和性腺的分泌，GABA 通过多巴胺抑制系统抑制垂体激素-促黄体激素和催乳素的分泌起作用。GABA 和孕激素的协同作用，能显著提高精子的活动能力 26。 1.2.4 预防肥胖 张辉等 29对长时间食用富含 GABA 米胚芽的大鼠进行研究，发现大鼠体重增加明显受到抑制，证明富含 GABA 米胚芽拥有预防肥胖的功效。 1.2.5 缓解酒醉症状 由于 GABA 能促进酒精代谢，因此可以用来醒酒，顾振新等 27研究发现饮酒者在食用富含 GABA 米胚芽后，血液中的乙醇以及乙醛浓度显著低于对照组。 1.2.6 调节心率失常 GABA 能抑制心律失常的发生，参与心血管功能的调节，梦娟好等研究发现 GABA 主要是通过对心脏的直接作用而对抗乌头碱性心律失常 27。 1.2.7 治疗癫痫 癫痫的产生和中枢神经递质之间有密切关系。癫痛是中枢神经系统的一种常见病，发病率为 0.5%1.5%，是一种引起脑功能障碍的临床综合症。癫痫病人脑脊髓中 GABA较常人显著低下，且其程度与发病类型相关 17。1.2.8 其它功能 贵州大学本科毕业论文（设计） 第 3 页GABA 还具有其他诸多生理功能，如多刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌。1.3 GABA 的生产GABA 的制备方法包括化学合成法和生物合成法。此外，又根据酶的来源不同，可将生物合成法分成植物组织代谢和微生物发酵两种。1.3.1 化学合成法化学合成法主要是通过 -氯丁氰的取代水合反应合成。邻苯二甲酰亚氨钾与 -氯丁氰于 180发生反应，然后用浓硫酸回流产品，结晶。因为化学合成法合成的GABA 常常有其它副产物或化学物残留物，在食品中应用有很大的局限性，主要应用于化工和医药领域中。 271.3.2 植物组织代谢植物组织代谢主要是使用内源酶转化制备 GABA。蔬菜、水果、谷物、海藻以及蘑菇等植物体都含有丰富的 GABA，例如菠菜中含量高达 414 nmol/g；栗子中的 GABA含量达 188 nmol/g；谷物中的 GABA 含量在 55718 nmol/g ，大米胚芽和大豆芽中含量较高 19，尽管很多天然食品中 GABA 的含量较为丰富，但是单单依靠从天然食物中获取 GABA 远远不能满足人体的需求。为了解决这一问题，众多科学家投身 GABA 的富集研究，目前，已取得了很多成果 8。发达国家对于食品来源的 GABA 富集和生产研究已经取得许多成果，在 2007 年日本可口可乐公司就推出了面向大众的，拥有放松和抗紧张功效的 GABA 饮料 26。利用红曲霉发酵生产具有很大商业化的开发前景。而我国对于 GABA 富集和生产技术的研究起步较晚，起点较低。随着 GABA 的生理功能逐步被人们了解及高血压等众多疾病的增多，很有必要加大 GABA 研究和开发力度。1.3.3 微生物发酵法微生物发酵法最先使用的是大肠杆菌，之后使用乳酸菌、曲霉菌等微生物发酵生产GABA。红曲霉研究历史悠久，安全性可靠且代谢产物种类多样，利用红曲霉发酵生产 GABA 具有独特的优势 12。GABA 作为红曲霉的又一重要代谢产物，2009 年我国已将其批准为新资源食品，它具有良好的生理活性。Kono 等 25对红曲霉产 GABA 进行了研究，-氨基丁酸的产率达到了 120ug/g。Wang 等 23用 Monascus 贵州大学本科毕业论文（设计） 第 4 页purpureusNTU601 进行固体发酵，GABA 含量达到了 5004mg/kg，Su 24等也报道了采用 Monascus purpureus 进行固体发酵，GABA 含量达到了 1200mg/kg。后家衡等 3红曲霉液态发酵工艺进行整体优化，得到的较好优化条件为：培养温度 35、初始pH5.0、摇床速度 120r/min，优化发酵条件下 GABA 的产量提高到 7.8269/L。雷恒 7等对红曲霉固态发酵工艺进行了优化，得到产 GABA 较佳的培养基：葡萄糖 5%，大豆蛋白粉 4%，KH 2PO4 0.15%，ZnSO 4 0.3%，NaNO 3 0.5%，MgSO 4 0.1%，在