壳聚糖基三维多孔复合支架材料的制备及其表征

（申请工学硕士学位论文）壳聚糖基三维多孔复合支架材料的制备及其表征培 养 单 位 ：材料科学与工程学院学 科 专 业 ： 材 料 科 学 与 工 程研 究 生 ： 龙 佳 指 导 教 师 ：吴 庆 知 副 教 授2016 年 5 月 壳聚糖基三维多孔复合支架材料的制备及其表征 龙佳 武汉理工大学 周英正 武汉理工大学分类号 密 级 UDC 学校代码 10497 学 位 论 文题 目 壳聚糖基三维多孔复合支架材料的制备及其表征 英 文 Preparation and evaluation of three-dimensional Chitosan-baesd 题 目 porous composite scaffolds material 研究生姓名 龙佳 姓名 吴庆知 职称 副教授 学位 博士 单位名称 武汉理工大学 邮编 430070 申请学位级别 工学硕士 学科专业名称 材料科学与工程 论文提交日期 2016 年 5 月 论文答辩日期 2016 年 5 月 学位授予单位 武汉理工大学 学位授予日期 2016 年 6 月 答辩委员会主席 王欣宇 评阅人 王友法 韩颖超 2016 年 5 月指导教师独 创 性 声 明本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签 名： 日 期： 学位论文使用授权书本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的全部内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大学认可的国家有关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息服务。（保密的论文在解密后应遵守此规定）研究生（签名）： 导师（签名）： 日期： I摘 要骨缺损是目前国内外临床医学中最常见、最棘手的困难之一，而骨组织工程在修复骨组织病变或缺损方面具有独特的优势。在骨组织工程中，支架材料起着至关重要的作用，它不仅将种子细胞和生长因子运送到骨缺损部位，而且还给新生骨组织提供支撑作用。近年来，生物可降解高分子材料广泛用于组织工程领域中，而壳聚糖（CS ）作为天然的高分子材料，具有良好的生物相容性和生物活性，其多糖骨架结构以及其独特的化学性质，有利于细胞的粘附和增殖，因而成为骨组织工程中研究较多的材料。羟基磷灰石是人体骨骼组织的主要无机组成成分，具有优良的生物活性和骨传导性能，可提供种子细胞在细胞质基质中粘附、生长和分化的生物刺激信号。然而，提高壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架材料的生物力学性能，满足临床应用中应力集中部位骨缺损修复的要求，仍是一个巨大的挑战。石墨烯及其衍生物具有优异的力学性能、大的比表面积和良好的生物相容性，因而不仅可以改善壳聚糖支架材料的力学性能，而且能提高其生物活性。本论文首先利用氯乙酸法对氧化石墨烯进行改性，提高其表面羧基的含量，得到羧基化氧化石墨烯（carbolylated Graphene Oxide, cGO） ，并通过傅里叶红外光谱（FT-IR）和 X 射线光电子能谱（XPS）对其进行表征；以多聚磷酸钠和氢氧化钙为原料，采用水热法制备纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHA） ，扫描电镜（ SEM）照片显示 nHA 的粒径均匀，平均尺寸约为 40-60 nm。其次，通过冷冻干燥法制备壳聚糖三维多孔支架，探讨了影响壳聚糖多孔支架微观形貌的主要因素，即壳聚糖浓度和预冷冻温度；在交联剂碳化二亚胺（EDC）和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的作用下，cGO 与壳聚糖进行共价交联反应，对 CS/cGO 复合支架进行 SEM 观察和力学性能表征，结果显示：随着cGO 含量的增加，多孔支架孔壁表面越来越粗糙；而当 cGO 的质量分数不高于 2.5 wt.%时，可提高壳聚糖支架的力学性能。此外，采用同样的方法制备了壳聚糖/羧基化氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三元组分的复合多孔支架，并对其进行了力学性能、形貌结构、元素分析（EDAX） 、FT-IR、溶胀性能、孔隙率以及体外降解实验的表征。实验结果表明：nHA 的加入使壳聚糖支架的力学性能、溶胀度和孔隙率显著降低，而添加 cGO 会延缓壳聚糖支架在 PBS 溶液中II的降解速率。最后，初步评估了壳聚糖基复合支架对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞相容性，结果表明 CS/cGO/nHA 复合支架对 BMSCs 的生长与增殖具有协同作用。关键词：壳聚糖，氧化石墨烯，纳米羟基磷灰石，多孔支架，间充质干细胞。IIIAbstractBone defect is one of the most common and intractable diseases in the clinical medicine. Bone tissue engineering has a unique advantage to repair the bone lesions or defects. The scaffold materials plays a vital role in bone tissue engineering, which not only transport the seed cells and growth factors to bone defect sites, but also support the new-grown bone tissue. In recent years, biodegradable polymer materials are widely used in bone tissue engineering. Chitosan (CS) as a natural polymer material, has good biocompatibility and biological activity. The polysaccharide skeleton structure and its unique chemical properties can promote cell adhesion and proliferation. Hydroxyapatite is the main inorganic component of human bone tissue with excellent biological activity and bone conduction performance, which can provide biologic cues for cells adhesion, growth and differentiation. However, it is still a big challenge to improve the biological mechanical al performance of chitosan/nanohydroxyapatite (nHA) composite scaffolds to satisfy the requirements of clinical application. Graphene and its derivates have excellent mechanical properties, large specific surface area, and good biocompatibility, which can improve not only the mechanical properties of chitosan-based scaffolds, but also their biological activities. In this paper, GO was prepared using Hummers method and functionally modified by carboxylation. The reaults of FT-IR and XPS characterizations confirmed the carboxylation of cGO. nHA was synthesized using sodium polyphosphate and calcium hydroxide as the raw materials through a hydrothermal process. SEM images showed that the nHA was uniform with an average diameter of 40-60 nm.Secondly, three-dimensional (3D) CS scaffolds were perpared by lyophilization. Several parameters, including the chitosan concentration and pre-freezing temperature, on the microstructures of the CS porous scaffolds were studied. Subsequently, CS/cGO scaffolds were prepared through covalent bonding between the carboxyl groups of cGO and amino groups of CS in the presence of EDC and NHS. The results indicated that the surfaces of pore walls become rougher with the increase of cGO content and the addition of cGO in CS matrix improved the IVmechanical properties when the cGO content was less than 2.5 wt.%. Furthermore, the CS/cGO/nHA porous composite scaffolds were prepared using the same precedures and characterized by mechanical properties, SEM, EDAX, FT-IR, swelling properties, porosity, and in vitro degradation. The results showed that the addition of nHA significantly decreased the the mechanical performance, swelling ratio, and porosity of the scaffolds. Finally, the cytocompatibility of the CS-based scaffolds was evaluated using bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).The results show that CS/cGO/nHA porous scaffold promoted the growth and proliferation of BMSCs through the synergistic effect derived from cGO and nHA.Key words: chitosan, graphene oxide, nano-hydroxyapatite, porous scaffolds, BMSCs.i目 录摘要 .IAbstract .III第一章 绪论 .11.1 骨组织工程 .11.2 骨组织工程支架材料需要满足的条件 .21.3 骨组织工程中用到的生物支架材料 .31.4 壳聚糖支架的制备及其在骨组织工程中的应用 .51.4.1 冷冻干燥技术 .61.4.2 湿法纺丝技术 .71.4.3 粒子聚集法 .71.4.4 快速成型法 .71.5 石墨烯的简介 .81.5.1 石墨烯的性质及其制备方法 .81.5.2 石墨烯材料的细胞毒性和生物相容性 .81.5.3 石墨烯材料在骨组织工程中的应用 .101.6 本论文的研究意义及研究内容 .121.6.1 研究意义 .121.6.2 主要研究内容 .12第二章 壳 聚 糖 /氧 化 石 墨 烯 /纳 米 羟 基 磷 灰 石 三 维 多 孔 复 合 支 架 的 制 备 与 表 征 .142.1 前言 .142.2 实验部分 .152.2.1 实验试剂与仪器 .152.2.2 冷冻干燥法制备壳聚糖基三维多孔复合支架 .162.2.3 样品表征及性能测试 .182.2.4 数据分析 .20ii2.3 结果与讨论 .202.3.1 GO 和 cGO 的 FT-IR、XPS 以及 Zeta 电位表征 .202.3.2 壳聚糖支架微观结构的表征 .222.3.3 多孔支架机械性能的表征 .262.3.4 壳聚糖/羧基化氧化石墨烯多孔支架的 FT-IR 表征 .282.3.5 CS/cGO/nHA 多孔复合支架的 SEM 和 EDAX 表征 .292.3.6 溶胀性能的测试 .302.3.7 支架孔隙率的测试 .312.3.8 多孔支架体外降解实验的表征 .322.4 本章小结 .36第三章 壳聚糖基复合多孔支架材料的体外细胞毒性研究 .383.1 前言 .383.2 实验部分 .393.2.1 实验试剂与仪器 .393.2.2 骨髓间充质干细胞（BMSCs）的提取和培养 .393.2.3 BMSCs 活细胞形态的观察 .403.2.4 细胞相容性 .403.3 结果与讨论 .423.3.1 骨髓间充质干细胞形态的观察 .423.3.2 壳聚糖基复合支架材料对 BMSCs 的毒性 .433.3.2 Hoechst33342 和 PI 染色的结果 .443.3.3 SEM 观察 BMSCs 在支架材料上的形态 .463.4 本章小结 .47第四章 结论和展望 .484.1 结论 .484.2 不足与展望 .49参考文献 .50硕士期间的研究成果 .57致 谢 .58武汉理工大学硕士学位论文1第一章 绪论1.1 骨组织工程由于肿瘤、创伤、疾病或人口老年化等原因造成的骨缺损问题每年折磨着众多患者，也一直是医学领域的难题之一，长期以来海内外科研工作者对此投入了大量的相关研究和临床实践。经过多年的研究，目前普遍用于骨缺损修复的方法是骨移植技术，通过植入具有良好生物活性的骨移植材料到缺损部位来修复