重金属对微生物毒性效应研究

武汉工业学院毕业论文论文题目：重金属对微生物毒性效应研究姓 名 学 号 院 系 化 学 与 环 境 工 程 学 院 专 业 环 境 工 程 指导教师 2010 年 5 月 15 日目 录中 文 摘 要 .英 文 摘 要 .1.前 言 .11.1 重 金 属 对 微 生 物 毒 性 研 究 现 状 .11.2 本 实 验 研 究 的 目 的 和 意 义 .32 大 肠 杆 菌 、 荧 光 假 单 胞 菌 和 枯草芽孢杆菌的 简 介 .42.1 大 肠 杆 菌 的 简 介 .42.2 荧 光 假 单 胞 菌 的 简 介 .42.3 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 简 介 .53 汞 ， 铬 ， 镉 ， 铅 对 大 肠 杆 菌 ， 荧 光 假 单 胞 菌 ， 枯草芽孢杆菌毒 性 的实 验 研 究 .73.1 细 菌 在 重 金 属 污 染 下 存 活 数 量 .73.1.1 实 验 材 料 和 仪 器 .73.1.2 实 验 步 骤 .73.1.3 结 果 与 分 析 .73.2 细 菌 在 受 到 重 金 属 污 染 后 在 细 胞 水 平 上 的 研 究 .93.2.1 实 验 材 料 和 仪 器 .93.2.2 实 验 步 骤 .93.2.3 结 果 与 分 析 .103.3 单 细 胞 凝 胶 实 验 .123.3.1 实 验 材 料 和 仪 器 .123.3.2 实 验 步 骤 .123.3.3 结 果 与 分 析 .134 微 生 物 和 重 金 属 相 互 作 用 的 应 用 范 围 及 发 展 前 景 .154.1 微 生 物 和 重 金 属 相 互 作 用 的 应 用 范 围 .154.1.1 重 金 属 污 染 的 微 生 物 学 评 价 .154.1.2 微 生 物 在 环 境 保 护 中 的 应 用 .154.2 重 金 属 和 微 生 物 相 互 作 用 的 发 展 前 景 . 16谢 辞 .17参 考 文 献 . 18I摘 要微生物不仅种类繁多，数量极大，分布广泛，而且具有繁殖迅速，个体微小，比表面积大，对环境适应能力强等特点，因而成为人类最宝贵、最具开发潜力的资源库之一。作为分解者，微生物在地球生态系统的物质循环过程中起着“天然环境卫士”的作用。众所周知，重金属不能被微生物降解并且对它们有毒害作用，本 次 实 验 是以 四 种 常 见 的 重 金 属 离 子 、 、 、 对 大 肠 杆 菌 、 荧 光 假 单2Hg6Cr2d2Pb胞 菌 、 枯 草 芽 孢 杆 菌 三 种 细 菌 生 长 过 程 的 毒 性 研 究 。 实 验 由 三 个 部 分 组 成 ： 将 三 种 细 菌 在 含 有 不 同 浓 度 的 、 、 、 的 固 体 培 养 基 中2622培 养 ， 通 过 计 数 的 方 法 以 确 定 每 种 金 属 对 大 肠 杆 菌 、 荧 光 假 单 胞 菌 、 枯 草 芽孢 杆 菌 的 最 小 致 死 浓 度 ； 在 荧 光 镜 下 观 察 经 重 金 属 污 染 后 的 细 胞 形 态 与 原细 胞 形 态 的 区 别 ， 确 定 重 金 属 是 否 对 细 胞 形 态 有 影 响 ； 对 经 重 金 属 污 染的 细 菌 DNA 进 行 单 细 胞 凝 胶 实 验 ， 以 确 定 重 金 属 是 否 对 细 菌 的 遗 传 物 质 产生 损 伤 。实 验 结 果 表 明 ： 重 金 属 离 子 对 大 肠 杆 菌 、 荧 光 假 单 胞 菌 、 枯 草 芽 孢2Hg杆 菌 三 种 细 菌 的 最 小 致 死 浓 度 5 、 3 、 3 ； 对 大 肠 杆Lm/Lmg/6Cr菌 、 荧 光 假 单 胞 菌 、 枯 草 芽 孢 杆 菌 三 种 细 菌 的 最 小 致 死 浓 度 为20 、 120 、 180 ； 对 大 肠 杆 菌 、 荧 光 假 单 胞 菌 、 枯 草Lmg/g/2Cd芽 孢 杆 菌 三 种 细 菌 的 最 小 致 死 浓 度 为 90 、 30 、 30 ；/对 大 肠 杆 菌 、 荧 光 假 单 胞 菌 、 枯 草 芽 孢 杆 菌 三 种 细 菌 的 最 小 致 死 浓 度Pb为 300 、 250 、 200 。/L/mg/关 键 词 :重 金 属 ， 大 肠 杆 菌 ， 荧 光 假 单 胞 菌 ， 枯草芽孢杆菌， 毒 性IIAbstractThe microorganisms are not only widespread with a wide range and a great numbers; but also have characteristics of rapid propagation, a small individual, large surface area and a great adaptability to the environment and so on. So the microorganisms have become one of resources of the most valuable, the most potential for development. As a decomposer, microorganisms play the role of “Guardian of the natural enviroment”in the material cycle of terrestrial ecosystems.As is known to everyone, heavy metals cant be decomposed by microorganisms and have toxic effects on them. This experiment researched the toxicity of four common heavy metal ions: 、 、 、 on the growth of 2Hg6Cr2d2PbEscherichia coli,Pseudomonas.fluorescens and Bacillus subtilis.The experiment consisted of three parts: determination of the most lethal concentration of each metal on the E.coli,P.fluorescens and B.subtilis by counting CFU method; observation of cell morphology after exposure to heavy metals by microscopy; detection of damage of DNA by single cell gel electrophoresis.The results showed that the minimum lethal concentration of E.coli,P.fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 52Hg、 3 、 3 ,respectively; the minimum lethal concentration of Lg/L/E.coli,P.fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 206Cr、 120 、 180 respectively; the minimum lethal concentration of m/g/mg/E.coli,P.Fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is d90 、 30 、 50 ,respectively; the minimum lethal concentration of L/L/E.coli,P.Fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 2Pb300 、 250 、 200 ， respectively.g/g/g/Key words： heavy metal，E .coli,P.fluorescens,B.subtilis,toxicity11.前言1.1 重金属对微生物毒性研究现状重 金 属 污 染 指 由 重 金 属 或 其 化 合 物 造 成 的 环 境 污 染 。 主 要 由 采 矿 、 废 气排 放 、 污 水 灌 溉 和 使 用 重 金 属 制 品 等 人 为 因 素 所 致 。 如 日 本 的 水 俣 病 和 痛痛 病 分 别 由 汞 污 染 和 镉 污 染 所 引 起 。 其 危 害 程 度 取 决 于 重 金 属 在 环 境 、 食 品和 生 物 体 中 存 在 的 浓 度 和 化 学 形 态 。重金属污染是当今世界三大水环境污染方式之一。重金属污染物主要包括汞、铬、铅、锌、铜、镍等，其种类、含量及其存在形态随产生条件而异 。1同时，重金属元素中许多为生物体正常生长所必需的元素，但大部分具有毒性且是致癌因子，过量排放到环境水体中容易破坏生态平衡，并通过食物链富集危害人类健康，因而水体的重金属污染治理逐渐成为人们研究的热点问题 。2重 金 属 一 般 以 天 然 浓 度 广 泛 存 在 于 自 然 界 中 ， 但 由 于 人 类 对 重 金 属 的 开采 、 冶 炼 、 加 工 及 商 业 制 造 活 动 日 益 增 多 ， 造 成 不 少 重 金 属 如 铅 、 汞 、 镉 、钴 等 进 入 大 气 、 水 、 土 壤 中 ， 引 起 严 重 的 环 境 污 染 。 以 各 种 化 学 状 态 或 化 学形 态 存 在 的 重 金 属 ， 在 进 入 环 境 或 生 态 系 统 后 就 会 存 留 、 积 累 和 迁 移 ， 造 成危 害 。 如 随 废 水 排 出 的 重 金 属 ， 即 使 浓 度 小 ， 也 可 在 藻 类 和 底 泥 中 积 累 ， 被鱼 和 贝 的 体 表 吸 附 ， 产 生 食 物 链 浓 缩 ， 从 而 造 成 公 害 。 如 日 本 的 水 俣 病 ， 就是 因 为 烧 碱 制 造 工 业 排 放 的 废 水 中 含 有 汞 ， 在 经 生 物 作 用 变 成 有 机 汞 后 造 成的 ； 又 如 痛 痛 病 ， 是 由 炼 锌 工 业 和 镉 电 镀 工 业 所 排 放 的 镉 所 致 。 汽 车 尾 气 排放 的 铅 经 大 气 扩 散 等 过 程 进 入 环 境 中 ， 造 成 目 前 地 表 铅 的 浓 度 已 有 显 著 提 高 ，致 使 近 代 人 体 内 铅 的 吸 收 量 比 原 始 人 增 加 了 约 100 倍 ， 损 害 了 人 体 健 康 。微生物不仅种类繁多，数量极多，分布广泛，而且具有繁殖迅速，个体微小，比表面积大，对环境适应能力强等特点，因而成为人类最宝贵、最具开发潜力的资源库之一。作为分解者，微生物在地球生态系统的物质循环过程中起着“天然环境卫士”的作用。它们几乎能降解或转化环境中存在的各种天然物质，一旦新的物质出现，也能逐步通过自发或诱导产生新的酶系，具备新的代谢功能。可以说，只要找到合适的微生物并给予适宜的条件，所有的污染物都可以得到降解和转化 。543众所周知，重金属不能被微生物降解并且对它们有毒害作用，但是微生物对重金属又有一定的抗性和解毒作用，可以吸附和转化重金属。两者间相互作用的研究可为湿法冶金、环境污染评价及生物净化提供理论依据。近年来，正是基于微生物对重金属的积累和解毒作用，以净化有毒金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日益成熟，微生物是现代工业发展的坚强后盾。微生物巨大的环境保护功能(生态毒理评价和生物修复)显得越来越重要。2因而研究重金属对微生物的毒性效应在环境工程中的应用将有着重大的意义，它是微生物应用的基础实验数据，并为其应用提供参考 。6已 经 有 很 多 的 学 者 对 重 金 属 对 微 生 物 的 毒 性 进 行 了 研 究 。 研 究 包 括 以 下几 个 主 要 方 面 ：1)重 金 属 对 微 生 物 群 体 的 影 响重 金 属 污 染 能 够 明 显 影 响 土 壤 或 水 域 中 微 生 物 群 落 ， 如 降 低 微 生 物 生 物。 降 低 活 性 细 菌 菌 落 的 数 量 等 等 ， 同 时 重 金 属 污 染 亦 能 明 显 影 响 微 生 物7 8群 落 结 构 ， 即 微 生 物 多 样 性 ， 已 有 研 究 表 明 微 生 物 群 落 结 构 的 变 化 能 较 早9地 预 测 土 壤 或 水 域 中 养 分 及 环 境 质 量 的 变 化 过 程 ， 被 认 为 是 最 具 潜 力 的 敏 感性 生 物 指 标 。 如 王 秀 丽 等 以 铜 锌 冶 炼 厂 附 近 的 水 稻 土 为 例 ， 研 究 了 重 金 属10复 合 污 染 对 土 壤 微 生 物 群 落 的 影 响 。 结 果 表 明 ， 铜 、 锌 、 镉 、 铅 与 微 生 物 生物 量 碳 、 微 生 物 生 物 量 氮 、 微 生 物 商 、 微 生 物 生 物 量 氮 /全 氮 均 呈 显 著 负 相关 ， 重 金 属 污 染 均 能 降 低 细 菌 、 真 菌 和 放 线 菌 的 数 量 。 用 BILOG 生 态 盘 研究 了 重 金 属 污 染 对 微 生 物 群 落 结 构 的 影 响 ， 发 现 重 金 属 污 染 明 显 影 响 了 微 生物 群 落 结 构 。12)重 金 属 对 微 生 物 个 体 的 影 响低 浓 度 的 重 金 属 可 刺 激 微 生 物 生 长 ， 而 高 浓 度 的 重 金 属 可 抑 制 微 生 物 的生 长 繁 殖 ， 甚 至 导 致 微 生 物 死 亡 。某 些 非 生 物 学 功 能 的 金 属 如 Hg、 Ag、 Cd 等 在 其 浓 度 很 低 时 即 有 高 毒性 。 Hg 的 毒 性 主 要 表 现 为 ： 抑 制 生 物 大 分 子 如 蛋 白 质 和 核 酸 的 合 成 ， 致 突变 效 应 ， 停 止 细 胞 分 裂 ， 抑 制 生 物 氧 化 及 运 动 性 。 Cd 也 具 有 致 突 变 效 应 ，导 致 DNA 链 断 裂 。 Pb 可 造 成 细 胞 膜 损 伤 ， 破 坏 营 养 物 质 的 运 输 。 高 浓 度 的Mn 干 扰 细 胞 对 的 运 输 ， 过 量 的 Ni 抑 制 酵 母 乙 醇 脱 氢 酶 的 活 性 。2 2 12Hosfall 总 结 出 金 属 阳 离 子 的 毒 性 顺 序 ： AgHgCuCdNiCoZn， 并 指出 这 种 顺 序 可 因 生 物 种 类 不 同 而 略 有 差 异 。 金 属 的 毒 性 还 与 其 自 身 的 化13学 性 质 和 金 属 硫 化 物 的 不 溶 性 顺 序 有 关 。 事 实 上 ， 两 者 的 顺 序 非 常 相 似 ， 即Hg AgCuPbCdZn。 金 属 的 毒 性 还 与 其 价 态 或 配 基 有 关 。 Hg 相 对 142于 Hg 而 言 毒 性 要 大 ， 而 有 机 汞 如 甲 基 汞 的 毒 性 是 无 机 汞 的 100 多 倍 。6 15As 的 毒 性 比 As 高 200 多 倍 ， Cr 毒 性 也 高 于 Cr 。3561633)重 金 属 对 微 生 物 的 毒 性 机 理重 金 属 对 活 的 微 生 物 作 用 分 两 个 阶 段 进 行 ， 第 一 是 伴 随 着 离 子 结 合 和电 势 增 加 的 生 化 吸 附 ， 第 二 是 离 子 被 吸 附 在 随 着 电 荷 减 少 而 发 生 阴 性 改 变的 细 胞 表 面 。 重 金 属 对 微 生 物 的 最 重 要 毒 性 作 用 是 使 带 有 机 能 基 因 硫 氢 基 的酶 的 失 活 。 许 多 重 金 属 表 现 出 对 其 他 生 物 配 位 体 如 磷 酸 、 嘌 岭 、 嘧 啶 和 核 酸3的 强 烈 亲 和 力 ， 有 的 还 可 以 作 为 抗 代 谢 物 ， 或 成 为 与 细 胞 膜 结 合 的 物 质 。17现 在 随 着 分 子 生 物 学 的 发 展 ， 重 金 属 对 微 生 物 毒 性 机 理 的 研 究 也 已 经 深 入 到了 分 子 水 平 ， 而 不 只 停 留 在 细 胞 水 平 。 关 于 重 金 属 生 物 中 毒 的 分 子 机 理 ， 目前 还 未 很 好 地 弄 清 楚 ， 但 是 从 大 量 的 生 物 毒 性 试 验 结 果 可 以 推 测 ， 毒 性 是 由于 重 金 属 与 生 物 大 分 子 作 用 造 成 的 。金 属 离 子 既 可 取 代 生 物 大 分 子 活 性 点 位 上 原 有 的 金 属 ， 也 可 以 结 合 在 该分 子 的 其 他 位 置 。 当 有 毒 金 属 离 子 与 生 物 大 分 子 上 的 活 性 点 位 或 非 活 性 点 位结 合 后 ， 可 以 改 变 生 物 大 分 子 正 常 的 生 理 和 代 谢 功 能 ， 使 生 物 体 表 现 为 中 毒现 象 甚 至 死 亡 。184)微 生 物 对 重 金 属 抗 性 的 研 究当 重 金 属 超 过 一 定 浓 度 时 ， 对 微 生 物 具 有 毒 害 作 用 ， 但 是 某 些 微 生 物 可以 通 过 生 物 解 毒 对 重 金 属 毒 性 产 生 抗 性 。 重 金 属 生 物 解 毒 是 指 微 生 物 把 抑 制其 正 常 生 长 繁 殖 的 有 毒 重 金 属 通 过 运 输 、 结 合 与 转 化 等 方 式 使 细 胞 内 重 金 属减 少 、 毒 性 减 弱 并 对 重 金 属 毒 性 产 生 抗 性 的 生 理 代 谢 过 程 。 研 究 表 明 ，19不 同 类 型 的 微 生 物 具 有 不 同 的 解 毒 抗 性 ， 如 真 核 微 生 物 ， 主 要 通 过 利 用 金 属硫 蛋 白 (Metallothionein， MT)螯 合 体 内 重 金 属 ， 以 减 少 破 坏 性 较 大 的 活 性 游离 态 重 金 属 的 存 在 ； 而 原 核 微 生 物 则 通 过 减 少 重 金 属 的 摄 取 ， 增 加 细 胞 内 重金 属 的 排 放 来 控 制 胞 内 金 属 离 子 浓 度 。 实 验 证 明 ， 白 色 链 珠 菌 (Candida albicans)主 要 利 用 由 Crdl 基 因 编 码 的 P1 型 ATP 酶 向 体 外 运 输 铜 ， 当 去 除菌 体 内 所 有 Crdl 时 ， C. albicans 便 丧 失 铜 抗 性 。201.2 本实验研究的目的和意义重金属的转化、净化一直是治理被污染环境的难点。近年来，对被重金属污染的环境进行生态恢复的思想和研究实践有所加强。由于微生物种类多、数量大、分布广、繁殖快、变异适应力强，成为最受关注的生态恢复生物类群。目前，已有很多关于微生物吸附和富集重金属离子、转化重金属化合物的报道，如假单胞菌和金色葡萄球菌固定银、枯草杆菌固定金和硒、硫弧菌和柠檬酸菌固定多种金属、绿藻固定多种金属、氧化亚铁钩端螺旋杆菌氧化还原多种金属化合物等，其中，绿藻对水溶液中的镉、汞、铅、铬的去除率可达 96以上。但在重金属对微生物的毒性效应方面没有系统的阐述。因此，本实验的研究可了解到汞 ， 铬 ， 镉 ， 铅 工业废物中常见的重金属对微生物生长过程中毒性效应，具体阐明了重金属对细菌群体数量、细胞形态及细胞遗传物质的影响，从而对重金属对微生物毒性效应研究及重金属对环境污染的微生物学提供了一定的依据，同时为重金属的生物处理技术也提供了基础资料。42.大肠杆菌、荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌的简介2.1 大肠杆菌的简介大肠杆菌(Escherichia coli， E.coli)是肠杆菌科细菌的模式种 (type species)。为革兰氏阴性的直杆菌，周身鞭毛运动或无运动，兼性厌氧，最适合生长温度为 37。在营养琼脂上的菌落为光滑型(S)、低凸起、湿润、灰白色、表面有光泽。边缘整齐，在生理盐水中易乳化；亦可为粗糙型(H)菌落，干燥，在生理盐水中不易乳化；也可有中间型菌落；亦有黏液型菌落。化能异养菌，氧化酶阴性，能以乙酸盐为唯一碳源，但不能利用柠檬酸盐。大肠杆菌能发酵葡萄糖及其他糖类产生丙酮酸，并可进一步转化为乳酸、乙酸和甲酸，部分甲酸可被复合的解氢酶系统分解为等量的二氧化碳和氢气。有的菌株不产气，大多数菌株发酵