树突状细胞在肿瘤免疫治疗中的应用与前景论文

树突状细胞在肿瘤免疫治疗的应用与前景摘要：树突状细胞(DC)是机体内最强大的抗原递呈细胞，具有诱导特异性的细胞毒性 T 淋巴细 胞生成的特殊功能。随着肿瘤学、免疫学及分子生物学的进步，人们对 DC 的认识不断深入。大量研 究表明，DC 在调控机体的免疫应答以及抗肿瘤过程中具有至关重要的作用。以 DC 为基础的肿瘤免 疫治疗以及 DC 疫苗等方面在临床应用取得显著进展，其作为肿瘤治疗手段展示了良好的应用前景。关键词：树突状细胞 肿瘤免疫 治疗1、肿瘤免疫与树突状细胞1.1 肿瘤免疫（ tumorImmunology）肿瘤免疫（tumorImmunology）是研究肿瘤的抗原性、机体的免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系，机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿瘤免疫的机制、肿瘤的免疫诊断和免疫防治的科学。设想肿瘤细胞可能存在着与正常组织不同的抗原成分，通过检测这种抗原成分或用这种抗原成分诱导机体的抗肿瘤免疫应答，可以达到诊断和治疗肿瘤的目的，但这方面研究没有取得明显的进展。1.2 树突状细胞（DC）1868年，Paul Langerhans 在皮肤组织中首次观察到 DC， 在1973年 Ralph Steinman 和 Cohn 在鼠的脾脏中分离出 DC 并发现其免疫功能。此后2O 年问，DC 在各种组织中被发现， 并能够在体外进行培养，因此加快了 DC 的研究并使临床应 用成为可能。目前认为存在两大类 DC：一类是骨髓源性 DC。 其中包括两个分支：是存在于皮肤样复层上皮的 LCs；是 其他组织中的间质性 DC(int DC)。它们共同的特点是分泌 1L一12，诱导 CIM T 增值，不同点是 int DC 可分泌 IL 一 10，诱 导 B 向浆细胞分化，而LCs 可能与细胞毒 CD8 T 活性有关； 另一类是类浆细胞 DC(pDCs)。是在病毒入侵体内后发挥作 用，在几小时内，分泌大量的抗病毒的细胞因子，因此判断 pDCs 有吞噬外源抗体，介导免疫起始的作用 。 从另一角度，可以将 DC 分为组织来源的和外周血来源 的。组织来源的 DC 是从外周组织中迁徙到淋巴结，在感染 中处于不稳定状态。血液来源的 DC 的整个生命周期都存在于脾脏和淋巴结。这两类 DC 也可以再加以细分。它们在不 同成熟阶段的抗原提呈能力表现出根本的不同 。通常认 为，DC 从淋巴系统迁移到引流淋巴结 draining lymph nodes (LNs)，是适应性免疫应答的开始。外周血中的未成熟 DC 通 过吞噬外来抗原等，转变为成熟DC，并向前哨淋巴结(sLN) 等淋巴器官迁移，同时吞噬能力减弱，抗原提呈能力加强。外来抗原入侵机体后，被 DC 吞噬，诱导 DC 成熟。成熟的 DC 表面分子发生一系列变化，已知 CCR7是成熟 DC 向次级 淋巴器官迁移的重要驱化因子，然而对 CXCR4的功能了解不多。在 CCR7一 CCL19与 CXCR4一 CXCL12两对比发现，CCR7 在 DC 迁移中发挥的作用要强 。Hansson 等 发现在幽门 螺杆菌刺激下，人 DC 的成熟、体外迁移、细胞因子的表达。并以非病原大肠杆菌刺激的 DC 做对照组。结果显示，幽门螺杆菌组可以诱导DC 成熟，CCR7表达升高，并向淋巴结迁移。Riter 等 j 发现，DC 从外周迁移到淋巴结，是在周围环 境的信号引导下，由 DC 自身基因表达的结构调节的。GM CSF 在 sLN 中的升高可以吸引更多的 DC。IL 一10和 COX 一2 却 阻碍 DC 成熟和向 DC 迁移。DC 的最大特点是能够显著刺激 初始 T 细胞(native T cel1)进行增值，而巨噬细胞和 B 细胞只 能刺激已经活化的或记忆性 T 细胞，因此 DC 是机体免疫应 答的始动者。单核细胞系统可以向巨噬细胞系和 DC 系分化，同时发挥吞噬并杀死病原体的功能，或介导 T 细胞免疫功 能，这主要取决于它的分化方向。已知单核细胞的分化取决 于驱化剂、外界刺激、分化因子，然而在体内复杂的生理条 件下是怎么分化的我们还有好多未知。近来，关于 DC 的抗 原提呈特性的研究，取得很多进展。例如发现 NOX2氧化酶 通过控制吞噬体酸碱度来调控DC 的抗原加工和提呈。DC 缺乏 NOX2将会增加吞噬体内酸性环境，抗原水解加快，结果 导致抗原提呈功能下降。如果 ECadherin 黏附分子缺失，这样的 DC 不能释放免疫因子，结果在体内诱导一种完全不同的 T 细胞免疫，即 CD8 T 细胞免疫耐受 。 近来研究证明，传统的认为皮肤对于外来的病原体的 T 细胞免疫来自淋巴结固有 DC，而非皮肤 DC，这是不科学的。表皮的慢病毒直接由 DC 提供持久抗原，皮源 DC 高表达作用 介导重组Lentivector 基因免疫 。众所周知，发热在微生物 感染时对人体是有益的，然而其机理却鲜为人知。DC 在发热时分泌脂多糖 LPS，调控 Tolllike receptors(TLRs)升高，感知 微生物的入侵，调控体温升高.1.3 DC 与肿瘤关系 肿瘤的发生发展与机体免疫系统的紊乱有着密切的联系，但具体机制尚未完全清楚。肿瘤细胞低表达或不表达 MHC 分子及共刺激分子，某些肿瘤细胞还能分泌产生大量免疫抑制细胞因子，肿瘤微环境通过各种机制导致 DC 的分化 成熟障碍及机体的免疫功能破坏，使肿瘤细胞逃脱机体的免 疫监视。肿瘤细胞经 Toll 样受体的配体转染后，其免疫原型大大增强，同时还能促进 DC 的成熟 。Permt 等 首次提出 在肺癌及周围肺组织中存在类浆样 DC，发现大多数 NSCLC 浸润到肿瘤局部的 DC 是未成熟的，即使经 Tol 样受体刺激后，仅部分表型成熟，它们表达共刺激分子和分泌细胞因子的能力是有限的，说明 TIDC 是弱的抗原提呈细胞。陈宇平等研究发现，P53基因突变表达与树突状细胞的成熟状态有密切关系，肺组织中 P53突变发生率明显升高，同时 CD83 阳性树突状细胞表达率明显减少，而 CDlot 阳性树突状细胞表达率明显增多，说明肿瘤微环境中浸润树突状细胞的成熟受到明显抑制。 2、DC 抗肿瘤机制在肿瘤的发生、发展过程中，机体免疫系统通过对肿瘤抗 原的识别激活免疫细胞，杀伤肿瘤细胞，从而起到抗肿瘤作用。 DC 作为专职 APC，因其具有极强的摄取、递呈抗原以及有效 诱导和维持免疫应答的能力，在抗肿瘤免疫中起到至关重要的 作用。DC 可通过多种机制发挥其抗肿瘤免疫作用。(1) 诱导细 胞免疫：DC 摄取肿瘤抗原后，将其加工处理为肽一 MHC 分子复 合物表达于细胞表面，进而与 T 细胞表面的 T 细胞受体(T cel receptor，TCR)结合，同时与 DC 表面高表达的 CD80、 CD86等共刺激分子协同作用，共同激活 T 细胞，启动 CD8。细 胞毒性 T 细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的免疫应 答。(2)增强体液免疫：一方面，DC 通过促进抗原特异性 CD4 辅助性 T 细胞(helper T cell，Th)的产生，促进抗体生成；另一方面，DC 直接作用于 B 细胞，促进免疫球蛋白的分泌。PDC 通过工型干扰素(interferon，IFN)的分泌，直接诱导初始和记忆 B 细胞分化为浆细胞，产生大量免疫球蛋白 IgM。(3)分泌多种细胞因子或趋化因子：DC 分泌的 IL-12 可诱导 ThO 细胞向 Thl 细胞分化，启动细胞性免疫应答，抑制 IL-12的产生则促进 IL-10的分泌及 Th2细胞极化。IL 一15 以膜结合方式存在于 DC 表面，显著刺激次级淋巴器官中自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的增殖。DC 还可分泌一种特异性趋化因子Dc_CK1(dendritic cellderived CC chemo kine 1)，选择性趋化初始型 T 细胞，增强对免疫应答的诱导作用。(4)DC 通过与某些肿瘤细胞相互接触，直接抑制肿瘤细胞的生长口 。(5)肿瘤抗原致敏的 DC 可释放一种具有抗原递呈能力的囊泡小体 exosomes，该小体内含有大量 MHC I、类分子和共刺激分子，能显著刺激抗原特异性 CD8 T 细胞增殖，并诱导抗原特异性 CTL 反应。3、DC 介导的肿瘤免疫治疗目前，以 DC 肿瘤疫苗为基础诱导的特异性抗肿瘤免疫 治疗已成为肿瘤生物治疗研究的热点，其基本原理是通过体 外细胞因子联合培养扩增出 DC，模拟 DC 的体内成熟过程， 并使其接触相应抗原物质(人工合成肿瘤多肽、肿瘤细胞溶 解物、肿瘤蛋白抗原、DNA 或 RNA 等)或应用基因工程使肿 瘤抗原基因通过载体导人 DC，将这些致敏 DC 回输体内作为疫苗可诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。来越来越多 的证据表明，这种过继性免疫治疗方式已日趋成熟，由 DC 激 活的细胞免疫在抗肿瘤过程中起着主导作用，显示出了 DC 肿瘤疫苗在肿瘤的预防和治疗的巨大前景。 3 1 DC 的体外扩增 DC 在外周血及组织中分布极少，难以直接获取。在体 外定向分化 DC 的方法出现以后，将 DC 应用于肿瘤特异性 免疫治疗的研究才得以快速发展。DC 的体外扩增方法主要有两种：来自骨髓 CD34 祖细胞。用 GMCSF 和 TNF 一细胞因子定向诱导扩增骨髓或脐带血 CD34 祖细胞可获得 分化成熟的 DC。成人外周血最易获取，HD CTX 后恢复期的血清较小牛血清和普通 AB 型血清更利于 Dc 生成；来自外周血 CD14 单核细胞。用 GMCSF 和 IL 一 4 细胞因子诱导分化外周血 CD14 细胞，可获得不成熟 MoDC，再加人不同的刺激物如 TLR 配体、TNF 一或单核细胞条件培养液等可分化为同源的具有较高活性的成熟 DC，体内和体外实 验均可诱导出 CTLs 。此外，有研究者发现外周来源的单核细胞与 LAK 细胞共同培养， LAK 细胞可促进 DC 细胞的成熟。但是，应用的 DC 多来自人体外周血单核细胞诱导、扩增，技术难度较大，这在一定程度上将会限制其大规模临床应用，因此现有 DC 扩增法还有待改进或发明新的高效 DC 制备方法。3 2 DC 疫苗 DC 能有效地呈递肿瘤抗原，使其能被 T 细胞识别从而激活机体的抗肿瘤免疫反应 ，目前用于肿瘤特异性主动免疫治疗的 DC 疫苗大致可分为两类，DC 多肽疫苗和 DC 基 因疫苗。DC 多肽疫苗有以下几种：肿瘤特异性表位肽刺激的 DC。来源于确定原的MHC I 类分子限制性的 710 个氨基酸肤段被最常用作 DC 疫苗，易于生产和标准化；肿瘤细胞溶解物致敏 DC。利用超声波破碎、反复冻融、诱导细胞凋亡的的方法制备肿瘤抗原；肿瘤细胞与 DC 的融合。采用聚乙二醇法或电融法将 DC 与肿瘤细胞融合，这种融合细胞既 能表达 DC 自身的表面免疫应答分子，同时又可获得肿瘤细胞的肿瘤抗原信息；Exosomes 小体负载 DC。由抗原递呈细胞分泌的 Exosome 富含主 MHC I、及其刺激分子，在肿瘤模型中可发挥有效的免疫刺激作用，已成为肿瘤免疫治疗的新热点。Exosomes可作为一种新型的亚细胞成分的 DC 疫苗，开辟一条无细胞体系诱导体内免疫功能的新途径。DC 基因疫苗主要包括负载 DNA 的 DC 疫苗、负载蛋白质的 DC 疫苗、负载 RNA 的DC 疫苗、导人编码肿瘤相关抗原的 DC 疫苗、及导入编码细胞因子基因的 DC 疫苗，通过提高其对抗原的摄取、加工、呈递能力，从而提高机体对肿瘤的抵抗能力。 3 3 DC 治疗肿瘤的临床应用 近年来，DC 的临床研究及应用已相当广泛，Nestle 等进行的第一个研究用一百万个负载了 KLH 和肿瘤抗原肤或肿瘤细胞裂解物的 DC 淋巴结注射，显示了较好的临床反应。Ni 等 采用自体肿瘤裂解液处理的 Dc 疫苗瘤内注射治疗 10 例淋巴瘤病人，有 1 例完全缓解、4 例部分缓解。Kuglar 等对 17 例晚期。肾癌病人用 DC 融合疫苗进行治疗，结果表明41的患者获得疗效，其中有 4 例完全缓解。Heise 等 刮对 13 例前列腺患者进行 PSAmRNA 转染致敏 DC，13 例患者体内 PSA 均有下降，无不良反应。近年来， DC 疫苗作为肿瘤生物治疗的方案已获的美国 FDA 批准正式进入临床试验，DC 疫苗的研究展现了极好的发展和临床应用前景4、展 望 自从 1992 年肿瘤免疫共刺激学说建立以来，抗原递呈细胞(APC)在肿瘤免疫治疗中的地位受到重视，尤其是 DC 在肿瘤治疗的研究取得了明显的进步。DC 疫苗的抗肿瘤治疗，是继传统的手术、放疗、化疗后又一新兴的方法，在恶性肿瘤的预防和治疗中显示了较好的应用前景，然而 DC 疫苗在临床应用中仍有很多问题存在，如原料不足，由于 DC 在自然状态下数量很少，且体外培养困难，存活时间短，一般不超过 2 周，成本高。另外 DC有许多亚 群，有的具有免疫增强，有的具有免疫耐受作用，如何增强 DC 抗原递呈的目的，优化肿瘤抗原疫苗，促进 DC 向抗肿瘤亚型分化，此外 DC 疫苗的最佳应用剂量、次数、途径与时间，疫苗佐剂联合应用等，迄今为止还需要更多的研究为制定一个标准的 DC 体外的制备和成熟的方案和有效的肿瘤抗原负载 DC 的方法以及 DC 疫苗回输到患者体内的最