第二章 DNA结构

第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 DNA的物理化学性质 第五节 超螺旋和拓扑异构,第二章 DNA的结构,第一节 遗传物质的本质,一、DNA携带两类不同的遗传信息,1、 遗传物质必须具有的特性,DNA的特征,a、贮存并表达遗传信息,各异的碱基序列储存大量的遗传信息,b、能把信息传递给子代,DNA的复制是其表达和传递遗传信息的基础,c、物理和化学性质稳定,生理状态下物理、化学性质 稳定,d、具有遗传变化的能力,有突变和修复能力，可稳定遗 传是生物进化的基础,2、 DNA携带两种遗传信息,a、编码蛋白质和RNA的信息(编码tRNA、 rRNA),64个三联体密码子 3个终止密码子 编码氨基酸的61个密码子有简并性、通用性,b、编码基因选择性表达的信息,基因选择性表达表现在： 细胞周期的不同时相中 个体发育不同阶段 不同的器官和组织 不同的外界环境下基因的表达与否以及量的差异,* 原核生物的结构基因占Genome的比例很大,x174phage 5386bp 结构基因用去5169bp 比例达96,* 真核生物的结构基因占Genome的比例很小,哺乳动物中结构基因只占1015,其余80以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息,所以又称调控序列,二、 RNA也可作为遗传物质,* RNA病毒 传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳） 如: 烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus ，TMV),* 类病毒（viroid）: 使高等植物产生疾病的传染性因子 只由RNA组成, 无蛋白质外壳保护, 游离的共价闭合环状单链RNA分子,三、 是否存在核酸以外的遗传物质,Prion (proteinaccous infections particle) 朊病毒蛋白质样的感染因子,羊搔痒病 (scripie),人类库鲁（ kuru） 病,牛海绵状脑炎(疯牛病),均由传染性病原蛋白颗粒引起,统称Prion (朊病毒),Prion 复制? 转录? 翻译?,人类朊病毒疾病、症状及发病机理,致死性中枢神经系统的慢性退化,病理表现：大脑皮层的神经原细胞退化、空泡变性、死亡、消失，最终被星状细胞取代，因而造成海棉状态,朊病毒带来了诺贝尔生理/医学奖 1997 Stanley B.Prusiner,发现朊病毒是作为老年性痴呆症等疾病的病原并能在寄主细胞中繁殖传播,第二节 核酸的化学组成,嘧啶Pyrimidines,嘌呤Purines,一、 碱基、核苷、核苷酸, 碱基Nitrogenous bases, 核苷（nucleotide）,嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子,核糖是戊糖 RNA核糖核苷 DNA脱氧核糖核苷,1,9, 核苷酸（nucleotide acid）,核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸,其中和、和之间是高能磷酸键,dNTP,碱基戊糖核苷 核苷磷酸核苷酸,核糖核苷三磷酸缩写为NTP,二、DNA分子的一级结构 (DNA sequence),1、 多聚核苷酸链 主链是核糖和磷酸 侧链为碱基,由3,5磷酸二酯键连接,2、 链的方向：同一个磷酸 基的3酯键到5酯键的方向 (53),5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA 默认书写顺序53,第二节 DNA的二级结构,* 1953. Watson & Crick,右手 B- DNA Double helix Model,一、 DNA双螺旋模型的提出（double helix model）,* 双螺旋的主链,磷酸二酯链(PhosphodiesterBackbone),C-G,T-A,碱基互补, 直径20,* 双螺旋模型参数, 螺距为34（任一条链 绕轴一周所升降的距离）, 每圈有10个核苷酸 （碱基）, 有大沟和小沟 配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称, 两个碱基之间的垂直 距离是3.4。螺旋转 角是36度,二、 影响双螺旋结构稳定性的因素,l 氢键 (Hydrogen bond 46 kc / mol),消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力,弱键, 可加热解链,氢键堆积, 有序排列(线性, 方向),l 磷酸酯键 (phosphoester bond 8090 kc / mol),l 0.2 mol / L Na+ 生理盐条件,强键, 需酶促解链,* 维持稳定性的因素,l 碱基堆积力 (非特异性结合力),( 1 kc / mol 0.6kc / mol ) n, 范德华力（Van de waals force） (1.7A/ 嘌呤环与嘧啶环 作用半径),(0.34 nm/碱基对间距), 疏水作用力 (Hydrophobic interaction),不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力.,(磷酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列 ),l 磷酸基团间的静电斥力,碱基内能增加(温度), 使氢键因碱基排列有序状态的破坏 而减弱,* 不稳定因素,三、双螺旋结构的基本形式, B-DNA 资料来自相对湿度为92所得到的DNA钠盐纤维, 此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋 Z构象等形式,DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同 一种双螺旋结构内参数存在差异的现象,原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键 磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键,A,B,Z,A,B,Z,大沟宽,小沟窄,小沟窄,大沟变深,小沟宽浅,大沟不存在,小沟窄而深,A,B,Z,Z-DNA Phosphate Backbone is Kinked,14,1、反向重复序列与二级结构 反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats ,IR） 又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中,有时也有不完全相同的情况,RNA和DNA中都可能存在 此外还可有directed repeatitive sequence, DR -正向重复序列,四、一些DNA序列的不寻常结构,C,反向重复序列间间隔较短或无间隔,反向重复序列间间隔较长,* 较短的回文序列可能是作为一种信号 如：限制性内切酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点,例如限制性内切酶 EcoR的识别位点 5GAATTC3 3CTTAAG5,（1） 形成条件,一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链 如： polyA/polyU polydA/polydT polyd (AG)/polyd(CT),2、三螺旋DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA),可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关,D.S. DNA + D.S.DNA,T.S. DNA + S.S. DNA,（2） 组成形式,第三条链位于B-DNA的 Major groove中,3、 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ),均有形成四股螺旋DNA的可能,形成条件串联重复的鸟苷酸, 已有实验结果表明真核细胞端粒中存在四链结构,可能的功能,A、 稳定真核生物染色体结构,B、 保证DNA末端准确复制,C、 与DNA分子的组装有关,D、 与染色体的 meiosis & mitosis 有关,第四节 DNA的物理、化学性质,DNA双股链的互补 是其结构和功能上的一个基本特征 也是DNA研究中一些实验技术的基础,一、DNA分子的变性,变性（denaturation 或融解 melting）：DNA双螺旋区的 氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这 一双链分离的过程叫做变性,1、条件：加热, 极端pH,有机溶剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等,2、变性过程的表现 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很 窄的温度范围 导致一些理化性质发生剧烈变化,表现为： 熔液黏度降低 沉降速度加大 浮力密度上升 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，他在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升,天然DNA和变性DNA的吸收值相差可达34,当浓度为 50g/ml时：,1.185,3、熔解曲线与融解温度(Tm值) 缓慢而均匀地增加DNA 溶液的温度（现可做到 0.1 分）可根据各 点的A260值绘制成DNA 的熔解曲线,这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94 的原因,1、 影响 Tm值的因素,（1） 在 A, T, C, G 随机分布的情况下 ，决定于GC含量,（2）GC%含量相同的情况下,GC%愈高 Tm值愈大,GC%愈低 Tm 值愈小,AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小,碱基排列对Tm值具有明显影响,36.7 57.02 ,Tm,136.12 72.55 , 嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响,即氢键数目相同，但相邻碱基的堆积力不同 从嘌呤到嘧啶方向的碱基堆积力作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆积作用,Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking,5 CA 3 3 GT 5,Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking,5 AC 3 3 TG 5, 生物体内仅UAA为最有效的终止密码子,因为：,UAA,AUU,的Tm值是最低的一个，即使生 理温度下也不稳定,（3） 大片段D.S DNA分子之间比较,片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关,（4） 小于100bp 的 D.S DNA分子比较,片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小,（5） 变性液中含有尿素，甲酰胺等,（6） 盐浓度的影响 每升0.18mol Na+是常用的标准条件,思考题：室温下蒸馏水中的DNA会如何？,pH 12,酮基 烯醇基,pH 2-3,NH2 NH2+ (质子化),改变氢键的形成与结合力,（7） 极端pH条件的影响,一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低,2、 常用的变性方法, 热变性, 碱变性,应用广泛，特别是用于变性动力学研究,缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链,pH11.3时，全部氢键被淘汰,无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法, 保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L,D.S DNA,S.S DNA,Denaturation , Renaturation,复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ),二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation）,概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火）,1、 影响DNA复性过程的因素 ：, S.S, DNA 的初始浓度 C0, DNA 分子中, 碱基的排列状况 (随机排列, 重复排列),3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,二、C0t曲线复性发生过程的讨论,dCt / dt = KC02,反应初始 t = 0, 单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）,单链 DNA浓度 = C0,反应达 t 时,单链DNA浓度 = Ct,K复性速度常数,包括两个因素：DNA的浓度（C，mol/L）和时间(s),dCt / dt = KC02 积分,Ct / C0 = 1 / (1+KC0t ),当 Ct / C0 = 1/2 时,Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2),K = 1 / Cot(1/2),Ct/C0是C0t的函数按此公式作图得C0t曲线,基因组的复杂性单一序列的长度重复序列的长度,复杂性的单位为核苷酸的数目,例如：含单一序列a, b, c, d,复杂性a+b+c+d,复杂性分子量,含106a, 103b, 10c, d,复杂性a+b+c+d,复杂性分子量,基因组的复杂性(genomic complexity),复杂性,* C0t和DNA的复杂性间存在线性关系：the more complex a DNA, the higher its Cot(1/2),1 :1062105 :0.42109 :4000,A typical mammalian C0t curve has three plateaus,* C0t曲线能解释单一来源的DNA所具有的不同复杂性部分,真核生物的基因组由 高度重复（highly repetitive)序列、 中度重复（moderately repetitive or mid-repetitive) 序列 单一（single copy)序列组成,四、富含AT序列和DNA双螺旋结构的呼吸作用, 高等生物染色体的某一区段，AT含量变化很大,很多有重要调节功能的的DNA区段都富含AT （原核、真核 复制起点、 启动子、终止子等区域）, DNA双螺旋结构的呼吸作用：DNA双螺旋结构内部， 配对碱基的氢键的迅速断裂和再生的过程, DNA内富含AT区段呼吸作用尤为明显 这对于某些特殊的蛋白质与DNA发生反应并阅读链内部的信息具有重要作用,第五节 超螺旋和拓扑异构,一、超螺旋（superhelix OR supercoil）,最早在SV40和多瘤病毒 中发现, 超螺旋是所有线性或环 形DNA的共有的重要特征,The supercoils of the SV40 minichromosome can be relaxed to generate a circular structure, whose loss of histones then generates supercoils in the free DNA.,1、 超螺旋结构的方向性,正超螺旋（positive supercoiled ）,导致左手超螺旋,以一根绳子做实验：原来的绳子的两股以右旋方向缠绕；在绳子的一端向紧缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个左旋的超螺旋以解除外加捻转的协变,负超螺旋（Negative Supercoiled ）,导致右手超螺旋,在绳子的一端向松缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个右旋的超螺旋以解除外加捻转的协变,超螺旋的形成总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展,所有生物的DNA几乎 有5%为 Negative Superhelix,二、超螺旋状态的描述,1、可用数学公式描述,Vinograd 方程式,L = T + W ( = + ),L 连接数（Linking number ） 双链DNA的交叉数， 不发生链断裂时，L为定值,T 盘绕数（Twisting number ） 双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数,W 超盘绕数（Writhing number） 直观上为双螺旋在空间的转动数,W= 负值（negative superhelix）W = 正值 ( positive superhelix）,420bp,* B-DNA是 力学上稳定 的结构( 10 bp/ helix),* 螺旋数改 变的结果之 一是产生超 螺旋 或是在B_DNA中保留一单链区域，但须能量的功给, DNA在水溶液中, 构型偏B型状态, DNA以10.5 bp/helix为最稳定构型, 小于10.5bp/helix 向正超螺旋发展(紧缩态), 大于10.5bp/helix 向负超螺旋发展(松弛态) 天然的DNA都是负超螺旋 但一些生命活动过程中存在正超螺旋,B-DNA的变化情况：,2、体外可产生正超螺旋 溴化乙锭（Ethidium bromide EB） 放线菌素D,a、EB的插入只改变盘绕数T使其降低 但L值不变,WLTL值不变T值降低W正值产生正超螺旋,360o/helix 360o-26o