病毒感染的实验室诊断PPT课件

病毒感染的实验室诊断,1,病毒感染实验室确诊的意义,2003年SARS爆发2008年手足口病的流行群体性发热临床工作中病原的确定 及时准确的实验室确诊非常重要,2,3,Dengue登革热,麻疹可疑病例的临床诊断发热38OC，出现斑丘疹和至少伴有以下一种症状：咳嗽，鼻炎或结膜炎（WHO）,EchovirusesEcho病毒,Measles 麻疹,Parvovirus B19微小病毒B19,HHV-6,Rubella 风疹,Others 其它,4,内容,病毒感染的实验室诊断方法简介检测的结果分析EBV感染的血清学诊断,5,病毒感染的诊断方法简介,6,病毒感染的诊断类型及方法,7,病毒感染的临床过程与诊断,8,ELISA的原理,病毒抗原/抗体包被在固相载体表面加入待检血清，抗原抗-体复合物洗涤，加入酶标记抗人免疫球蛋白，与抗原抗体复合物特异性结合洗涤，加入底物显色，测OD值,9,10,ELISA结果的判定,目测法：一般加底物后，肉眼下出现颜色的为阳性，无色为阴性临界值法：以标本OD值阴性对照平均OD值加2-3个标准差作为阳性结果的阈值S/N值法：以S/N值2.1为阳性， S/N值 2.1而1.5为可疑， S/N值1.5为阴性,11,免疫荧光法,间接法和直接法间接法1）固定2）冲洗3）与第一抗体结合4）与第二抗体及免疫荧光抗体结合5）冲洗6）封片、观察,12,DEAFF test for CMV,(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital),13,PCR,一、PCR基本原理 PCR是一种快速和简便的DNA体外扩增技术。在模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸存在的条件下，利用耐热DNA聚合酶进行聚合反应，经变性、退火及延伸三步骤多次循环，对特定DNA模板进行扩增。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。,14,PCR的要求,目的基因的序列设定引物PCR实验要求的原料：引物、酶、dNTP、Mg+、模板及缓冲液,15,PCR一次循环包括三个基本步骤： 1.变性(denaturation)：加热至9096C，DNA 双链模板变成单链 2.退火(annealling): 缓慢降温至30-65 C ，引物 与单链DNA模板互补结合 3.延伸(extention): 升温至7074C, DNA链延伸 （需TaqDNA聚合酶，dNTP， Mg2+） 循环30次，特异DNA产量达230拷贝(约109),PCR基本步骤,16,PCR扩增靶DNA示意图,双链靶DNA,变性,退火,延伸,5,3,5,3,5,5,3,3,17,18,19,PCR反应步骤,预变性,退火,延伸,变性,20,PCR animation,21,常规PCR产物确认,22,荧光定量PCR,23,荧光定量PCR的标准曲线,24,病毒分离,标本接种于敏感细胞观察细胞病变病毒的鉴定：PCR，IF等,25,Cytopathic Effect,Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells. (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town),26,检测结果的分析,27,一、血清中特异性IgG和IgM的意义,单份血清特异性IgG阳性，只能说明过去有过病毒感染，而不能确定最近感染。只有在发病初期检测不到抗体或滴度低，而恢复期抗体4倍以上升高才有诊断意义。测定单份血清中的特异性IgM抗体，有助于疾病的早期快速诊断，但临床诊断中要结合病程、临床表现和病毒类型综合考虑。,28,Typical Serological Profile After Acute Infection,Note that during reinfection, IgM may be absent or present at a low level transiently,29,检测IgM应注意的问题,持续的IgM反应：如风疹、CMV等早期妊娠感染或先天性感染的儿童，特异性IgM可能持续达1年或更长时间IgM型抗体阴性： 1）病程：风疹、出疹后第1天，45%能查到IgM；麻疹、出疹后3天内，70%左右能查到IgM 2）病人的免疫功能：免疫抑制病人,30,3）局部感染4）隐性感染的再激活和再次感染（EBV、CMV等人疱疹病毒）：产生的特异性的IgM少，应查双份血清的特异性IgG多种病原体IgM抗体同时阳性1、IgM持续时间2、交叉反应：肠道病毒、黄病毒,31,二、PCR检测结果的分析,PCR检测阳性：并不一定说明是病原或活动性感染，要结合临床、标本来源等综合分析 可能是正常携带病毒或潜伏感染，如肠道病毒，正常人粪便中可以检测到，但脑脊液中检测阳性则有临床意义,32,CMV尿荧光定量PCR阳性不能用于判断疗效和指导治疗，但血清中定量PCR与病情严重程度相关PCR检测阴性：要结合临床病程分析 呼吸道病毒感染、肠道病毒感染一般710天后可能检测不到病毒核酸,33,三、病毒分离结果,敏感性较低结合临床病程、症状体征和标本来源综合判定： 1、阳性结果，是否与临床相符（SARS与衣原体） 2、阴性结果，是否病程已过急性期,34,儿童手足口病患者病原检测,35,原发性EBV感染的诊断,36,人类疱疹病毒,37,Burkitts lymphoma in Kenya,Epstein-Barr virus (EBV)1964, discovered from Burkitts lymphoma tissue by Epstein, Achong, and Barr1968, the etiologic agent for infectious mononucleosis1970, nasopharyngeal carcinoma1980, non-Hodgkins lymphoma,38,EBV 相关疾病,传染性单核细胞增多症（Infectious mononucleosis，IM）慢性活动性EB病毒感染（Chronic active EBV infection，CAEBV）EB病毒相关性嗜血细胞综合征（EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS),39,伴性淋巴增殖综合征（X-linked lymphoproliferative syndrom）鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma）Burkitts 淋巴瘤（Burkitts lymphoma）何奇金淋巴瘤（Hodgkins lymphoma）,40,41,EBV-IM的临床表现,发热： 约1周，严重者2周或更久，幼儿可不明显淋巴结肿大：任何淋巴结，颈部最易受累咽炎：50有渗出物，25上腭有瘀点脾肿大：病程23周，50出现肝炎：肿大1015，而GPT升高80皮疹：红斑、斑丘疹或麻疹样疹，50可有眼睑浮肿,42,EBV-IM的临床表现,其它：1.间质性肺炎2.CNS: 脑炎、格林巴利综合征等3.心肌炎4.血液系统：溶血性贫血、再障、粒细胞减少5.肾炎6.关节炎7.胰腺炎,43,EBV抗体四项,VCA-IgGVCA-IgMEA-IgGNA-IgGVCA-IgG亲合力,44,衣壳抗原（CA）IgM,一般情况下：一周左右升高，持续存在48周，类风湿因子和IgG抗体可致结果假阳性临床要注意以下情况： 1、有的病人抗EB病毒CA-IgM产生延迟 2、少部分病人感染EBV后，CA-IgM持续阴 性 3、也有的病人CA-IgM持续几个月阳性,45,抗体亲合力检测,机体在受到病原体入侵时首先产生低亲合力抗体，随感染的继续和进展，抗体亲合力升高。因此，低亲合力抗体的检出提示原发性急性感染。原发EBV感染，100的病人在第一个月内可检测到抗EB病毒CA-IgG低亲合力抗体,46,47,病程,周,月,抗体滴度,早期阶段,晚期阶段,症状,原发性EBV感染的体液免疫,48,晚期,早期,复发,病程,周,月,抗体滴度,EBV感染的再激活,恢复期,49,体液免疫的特殊情况,50,220例IM病人血清中EBV抗体四项结果,51,EBV抗体四项结果分析1,52,EBV抗体四项结果分析2,53,1,4,2,5,3,1,说明：图1为VCA-IgG，阳性；图2为VCA-IgG，提示为低亲和力； 图3 为VCA-IgM，阴性；图4为EA-IgG，阴性；图5为NA-IgG，阴性,病程4天外周血EBV抗体结果,54,病程8天外周血EBV抗体结果,说明：图1为VCA-IgG，阳性；图2为VCA-IgG，提示为低亲和力； 图3 为VCA-IgM，阳性；图4为EA-IgG，可疑阳性性；图5为NA-IgG，阴性,1,2,3,4,5,55,说明：上二图中，从左到右，前4条曲线为标准品； 第5条曲线为病程8天， CT值 为19.73，EBV-DNA为8410.54拷贝/ml; 第6条曲线为病程4天，CT值为24.00，EBV-DNA为4