疾病相关遗传位点的识别 PPT课件

2014级 “生命科学综合”核心课程疾病相关遗传位点的识别 Dissection The Genetic Loci Of Diseases,1,11个让你与众不同的“标签”,DNA,指纹,脸部,步态,耳朵,眼睛,声音,气味,心跳,脑波,微生物组,2,Now this is not the end. It is not even the beginning of the end.But it is, perhaps, the end of the beginning Winston Churchill,3,遗传变异 大爆炸初始的量子涟漪,4,疾病遗传学的范畴 Germline variation: inherited or de novo Causal variants Associated or related variants (risk) Somatic mutation: tumor, TCR/Ig repertoire Epigenetic regulation,5,一、如何识别疾病相关的遗传变异,6,完全由遗传决定的疾病基本由遗传决定，但需要环境诱因遗传和环境因素都起作用完全由环境因素决定,染色体病、单基因病复杂疾病（多基因病）,三种类型遗传疾病的人群患病率,7,疾病相关遗传变异识别的要素,疾病表型的界定：定义、类型、机制样本类型及数量 家系 病例和对照研究策略遗传标记及分型方法分析和解读功能解释,8,一张肝功报告单引发的“不和谐”,检验出错？肝炎后淤胆？肝硬化失代偿？抗病毒药物不良反应？治疗？ Vs. 不治疗？,9,高间接胆红素血症的表型,新生儿核黄疸罕见病青少年或成年苯巴比妥治疗自限性表现常见病,10,UGT1A1基因变异类型决定遗传性高间接胆红素血症的表型,罕见,常见,11,疾病遗传学研究策略取决于变异遗传效应强度和变异的频率,Manolio TA, et al. Nature 2009; 461: 747-753,基于候选基因的遗传关联研究基于全基因组范围的遗传关联研究,基于家系的连锁定位研究外显子组/全基因组直接测序,12,人类遗传变异 染色体变化（数目、转位） 重排，大片断插入/缺失 多碱基变异 微卫星, 重复序列 多等位 HLA 超过 1100 个等位 单碱基变异（SNV/SNP） 双等位 颠换 transversion 转换 transition 单碱基插入/缺失（indel） 拷贝数变异（CNV） 线粒体遗传变异,13,遗传标记的迅猛发展：从少到多，从稀到密,14,宇宙微波背景辐射,疾病遗传学的研究思维：从现在推测过去，从存在推测起源,15,基于疾病家系的连锁分析,16,基于散在人群的遗传关联研究人类基因组的连锁不平衡结构影响疾病的位点显示关联信号,17,二、经典文献导读,18,Remeo S, Kozlitina J, Xing C, et al. Genetic variation in PNPLA3 confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease. Nat Genet 2008; 40(12): 1461-1465非酒精性脂肪性肝病Molho-Pessach V, Rios JJ, Xing C, et al. Homozygosity mapping identifies a bile acid biosynthetic defect in an adult with cirrhosis of unkown etiology. Hepatology; 2012; 55(4): 1139-1145 胆酸合成缺陷性肝硬化,19,1. 常见复杂疾病的GWAS研究范例,常见复杂疾病高血压、糖尿病、痛风、神经精神系统疾病、肿瘤、感染Remeo S, Kozlitina J, Xing C, et al. Genetic variation in PNPLA3 confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease. Nat Genet 2008; 40(12): 1461-1465非酒精性脂肪性肝病,20,常见复杂疾病慢性病多基因病复杂性状多基因性状 定量性状 定性性状 基因-基因相互作用 基因-环境相互作用 年龄、性别修饰 生活、行为方式 饮食、营养,21,过去：大海捞针、局部信息 现在：一网打尽、整体认识,科学思维：GPS全球卫星定位,22,科学假说：人类基因组的连锁不平衡结构大样本人群全基因组范围捕获疾病的位点的关联信号,23,Materials and MethodsUniversity of Texas Southwestern Medical Center 发现队列：The Dallas Heart Study，3551名研究对象（欧裔、非裔、西班牙裔） 临床资料：血压、BMI、饮酒量、空腹血糖、血生化指标 专项检测：2240人还检测了肝脏甘油三酯含量 （ 1H-MRS ） 遗传标记及分型：全基因组范围12138个非同义SNPs, Perlegen SNP芯片分型 验证队列：Atherosclerosis Risk in Communities Study (ARIC, n = 14821) 验证队列rs738409分型：MGB-TaqMan方法 关联基因PNPLA3的人群变异负载观察：PCR-毛细管测序,24,PNPLA3变异影响肝细胞脂肪量和脂肪性肝炎,rs738409C GI 148 M,PNPLA3编码蛋白为481个氨基酸，属于patatin-like磷脂酶家族，具体功能不清楚Patatin是土豆的富含蛋白， 表现出非特异脂酰基水解酶活性,25,26,rs738409 C G, I 148 M,PNPLA3 rs738409 G 等位与肝脏脂肪含量相关，与糖、脂代谢异常无关,27,rs6006460G TS453I,三个无效变异个体均在高脂肪含量组 ，表明 PNPLA3失功能变异导致脂肪含量升高,在非裔中找到另一个PNPLA3基因的获功能变异rs6006460 (S453I)与肝脂肪量相关,28,PNPLA3功能变异的频率可以解释不同人群脂肪肝发病率African Americans 24%, European Americans 33%, Hispanics 45%,Loss,Gain,不同祖先人群肝脂肪量差异的72%可归因于I148M和S453I变异,29,本研究的亮点创新性：肝细胞脂肪量GWAS、PNPLA3决定性位点重要性：发现决定肝细胞脂肪量的因素独立于血脂、BMI、糖尿病 发现了新的脂肪肝机制和靶点（PNPLA3途径） 两个独立的遗传变异，Gain和Loss 人群变异频率反映了人群发病率的高低 与脂肪性肝损伤的关联艰巨性：大样本人群（n = 3383）、独立样本验证（ ARIC ） 氢谱核磁共振方法测定了肝细胞脂肪量（n = 2240）,30,本研究的不足SNP标记覆盖度不高 12138 nsSNPs分型，最终9229个参与分析 漏掉了调控区SNPs、CNVs、潜在的新基因/miRNA区域关联区域的连锁不平衡结构没有分析未进行第二轮独立验证 ARIC人群为验证人群，仅验证了其他指标如BMI、血脂等 ARIC人群缺肝细胞脂肪量数据，阳性性状缺独立样本验证功能证据 未检测不同基因型PNPLA3的酶活性（组织或细胞水平）,31,Diabetes 2009;58(11):2616-23 肝脂肪含量（德国） J Biol Chem 2010;285(9):6706-15 I148M变异阻碍甘油三酯水解（作者团队） PNAS 2010;107(17):7892-7 PNPLA3的SREBP-1c正反馈转录调节（作者团队） Hepatology 2010;52(3):904-12 成人NFLD肝组织损伤程度（麻省总医院） Hepatology 2010;52(3):894-903 儿童NAFLD肝组织损伤程度（NIH） Hepatology 2010;52(4):1281-90 肥胖儿童/青少年肝脂肪变性（耶鲁大学） PLoS Genet 2011;7(3):e1001324 肝脂肪变性（密歇根大学） PLoS Genet 2011; 7(4):e1001374 血清可溶性ICAM-1水平（哈佛医学院） J Biol Chem 2011; 286(43):37085-93（作者团队） 蛋白功能研究证实PNPLA3特异水解甘油酯，I148M导致此水解活性受损 Hepatology 2012; 55(3):781-9 青少年NAFLD（耶鲁大学） Hum Genet 2012; 131(7):1145-52 NAFLD发生（马来西亚） J Clin Invest 2012; 122(11):4130-44 I148M转基因鼠证实PNPLA3对肝细胞TG的重塑作用（作者团队） PLoS One 2012;7(11):e50256 NAFLD发生（中国） PLoS One 2013;8(3):e58734 PSC患者的生存预后（德国）,后续研究,32,脂肪肝的新机制、新靶点,33,2. 罕见单基因疾病遗传学研究范例,罕见单基因疾病杜氏肌营养不良、地中海贫血、Wilson病、先天性免疫缺陷Molho-Pessach V, Rios JJ, Xing C, et al. Homozygosity mapping identifies a bile acid biosynthetic defect in an adult with cirrhosis of unkown etiology. Hepatology 2012; 55(4): 1139-1145遗传代谢性疾病：胆酸合成障碍,34,基于疾病家系的连锁分析,35,纯合子作图一种特殊的连锁分析,适用于近亲结婚引起的隐性遗传病较小的家系、较少的病患数实验量小，定位迅速,Hypothesis致病基因区域一定是纯合子区域,36,首发病例（proband）A 24-year-old Arab woman (III.14)，来自伊朗西南部Khuzestan 不明原因的肝硬化，伴有门脉高压、腹水、静脉曲张黄疸、皮下瘀斑、脾大、轻度的足部水肿肝功能指标：AST 67, ALT 50 IU/L, ALP 153 IU/L, and a normal GGT level (14 IU/L)，总胆红素 1.8 mg/dL (normal 0.2-1.3 mg/dL) ，直接胆红素 1.3 mg/dL (normal 0.0-0.3 mg/dL), INR 2.0 (normal range: 0.8-1.2), 白蛋白 3 g/dL (normal range: 3.4-5.4 g/dL)腹部CT：结节性肝脏, 胃食管静脉曲张, 脾脏24 cm 肝活检：桥接样纤维化，肝小叶周围胆管异常实验室检查排除了Wilsons病，血色病, a1 抗胰蛋白酶缺陷以及病毒性、自身免疫性肝病否认饮酒史,37,家族史调查Her sister and a rst cousin died of cirrhosis (ages 19 and 6 years) and another 32-year-old rst cousin had a self-limited liver disorder in childhood that resolved at age 9 yearsThe family history suggested that the affected family members were homozygous for a mutant allele inherited identical-by-descent,38,全基因组纯合子作图：两个患者，一个健康堂妹全基因组范围240万个SNP分型 Human-Omni 2.5BeadChip microarray (Illumina),候选区域筛选标准：Regions of homozygosity 3 Mb are shown The regions that were present in both affected family members that were not homozygous in an unaffected family member are shown in boxes总共5个符合条件的纯合子区域,39,16号染色体一个6.3 Mb 纯合子区域 (25,073063-31,378235)符合筛选条件此区域有一个可疑后续基因HSD3B7测序发现两个患者的HSD3B7基因外显子1都有2bp缺失变异 (c.45_46del AG, p.T15Tfsx27) ，而健康堂妹没有此变异对其他家系成员进行测序验证,候选基因HSD3B7测序,40,负离子FAB-MS检测确认 3-HSD缺陷,胆酸合成缺陷的生化学确认,The triplets of ions at m/z 453, 469, and 485 (sulfate conjugates) and m/z 510, 526, and 542 (glyco-sulfate conjugates) are characteristic of monohydroxy, dihydroxy, and trihydroxy bile acids, respectively, with a structural feature of a 3b-hydroxy-D5 structure,41,本研究的亮点 先症者胆酸合成缺陷，但存活了20余岁没有治疗 先症者堂姐（家族成员III.5）9岁时出现过严重的肝病表现，但其后23年一直没有症状。这是迄今报道的唯一的无临床表现的成年3-HSD缺陷者，也是年纪最大的 3-HSD酶缺陷患者。患者也没有脂肪吸收障碍或软骨病的表现 有报道的唯一1名成年 3-HSD酶缺陷者在出生后有新生儿淤胆和软骨病，26岁再次出现淤胆症状 临床重要性：疑难诊断的范例，诊断出来即可特异性治疗，诊断清楚后预后良好,42,本研究的局限 不是新的疾病 不是新的致病基因 不是新的致病变异 无法解释同样的纯合变异、同样的生化缺陷 变异外显度和患者表型的差异后续需要做的研究 建立人类3-HSD缺陷遗传变异数据库 功能变异的外显度因素（de novo变异的异位显性、补偿） 产前诊断、慢性肝病鉴别诊断筛查,43,三、疾病相关遗传位点识别的前沿与展望,44,全基因组关联研究（GWAS） 高通量平行测序（NGS）,针对常见复杂疾病（ 2006年） 针对单基因病和低频变异（2008年）,整体解析时代：标志性、引领性前沿技术,45,Rare variations, rare diseases (exome resequencing)Common variations, common diseases (GWAS)Intermediate?,？,Functional relationship? Penetrance? Interactions?,46,我们关于一个不明原因肝硬化家系的外显子组序列分析,建立足够数量和质量的疾病遗传资源库鉴定疾病特异性、人群特异性的致病变异,47,鉴定散发病例的致病变异存在挑战：组合模式? 变异负载?,Cell 2011; 145: 1036-1048,建立变异-表型数据库,48,Nature 2014; NEJM 2014,49,绘制常见复杂疾病的全基因组遗传关联图谱,全基因组范围有多少个位点影响疾病的发生、发展 每个位点贡献了多大的比例 关键的功能变异集中在哪些通路（潜在干预靶点）,50,SNPs associated with autoimmune disorders that fall within DHSs, 24.4%localize in recognition sequences of TFs that interact with IRF9,Science 2012; Science 2014,51,eSNPs shared between cell types may lead to opposing directional effects on gene expression in a cell typespecific manner,Nat Genet 2012; Science 2014,52,A Genomic Road Map for Complex Human Disease,Science 2014; 343: 1087-1088,53,A human CLP1 mutation causes brain and motor neuron degeneration Mutation impairs kinase activity, nuclear localization, and TSEN complex assembly,Cell 2014; 157(3): 636-650. Cell 2014; 157(3): 651-663,定义新的疾病亚型及其病因：脑桥小脑发育不全亚型10,CLP1基因负责调控细胞中的 tRNA 代谢，其罕见突变引起一种以头围减小、感知和运动能力受损为特征的疾病,是一种新型的PCH亚型如果完全以患者症状或临床表现来定义疾病，是很难将这种新遗传病区分出来的。明确了致病基因之后，就看到了患者之间的共同特征。这与传统的疾病定义模式完全相反，代表了医学领域的一个转变,54,EoE过敏症是一种可引起食道僵硬进而导致胃灼热和固体食物摄入困难的疾病。先前研究显示，EoE病人的一种未知过敏会导致嗜酸粒细胞这种可诱发炎症产生的白细胞在食道处聚集。新发现的易感基因CAPN14在食道中有特别的高水平表达，但在具有风险相关突变的个体中却是低水平表达 Nat Genet 2014; 46: 895-900,疾病机制：嗜酸性粒细胞性食管炎为什么局限于食道？,55,解码基因组 smORF 假基因/重复基因 lncRNA 表观allele Super-enhancer 远端调控元件 Duons密码子 多倍体,56,利用CRISPR/Cas9饱和基因编辑和深度测序技术研究大量突变的功能影响,Nature 2014; 513: 120-123,57,Hepatology 2011; 53: 708-711,Modeling and Therapy of Human Liver Diseases Using iPS cells,58,Targeted gene correction of a1-antitrypsin deficiency in iPS cells,Nature 2011;478: 391-394,59,疾病遗传变异研究的意义 疾病机制（干预靶点） 个体化医疗 筛查、预测 遗传纠正,临床表型定量性状,常见或者罕见,致病变异及其基因,功能分子通路,药物靶点,药物基因组,毒理基因组,发病机制,诊断、分型,新型疫苗,个体化医疗,60,传染病： 轻微/重症 进展/非进展 结核 脑型疟 登革休克综合征 Ebola病 Prion病 ,感染同样的病原体只有一部分人表现症状,Why?,感染的发生、发展和结局在人群中表现出巨大差异,病原携带状态 急性感染 慢性感染 隐性感染 潜伏感染 显性感染 ,61,2000年 全军传染病研究所 2007年 传染病学国家重点学科 2011年 全军研究所复评为优秀 2012年 医院首批研究型学科、研究型团队 2012年 全军新发与重症传染病研究重点实验室 2013年 国家临床重点专科,临床检验,