【食品课件】第05章 食品中微生物毒素的测定技术

食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术 第五章食品中微生物毒素的测定技术第一节 食品中黄曲霉毒素的测定方法第二节 食品中杂色曲霉毒素的测定方法第三节 食品中赭黄曲霉毒素的测定方法第四节 食品中葡萄球菌肠毒素的测定方法食品中微生物毒素的测定技术第一节 食品中黄曲霉毒素的测定方法一、概述黄曲霉毒素（ Aflatoxin,简称 AFT） 是由黄曲霉和寄生曲霉等产毒菌株的代谢产物。1化学结构它是一组化学结构类似的化合物，其基本结构均含有一个双氢呋喃环和一个氧杂萘邻酮。目前已知的黄曲霉毒素约有 26种，除了有黄曲霉毒素 Bl、 B2、 Gl、 G2、 ML、 M2、 B2a、G2a、 BM2a、 GM2a外，尚有多种黄曲霉毒素的代谢产物、异构体和相似物，如 L、 L-H1、 2， 3-二羟基 Bl、 Bl-2， 3环氧化物、四氢脱氧 - Bl、 1-甲氧基 B2、 2-甲氧基 B2、 1-乙氧基 G2、 1-乙氧基 B2、 1-乙酰氧基 B2、 GM1、 Q1、 Q2a、 Q1-HS、 B3、 P1等。食品中微生物毒素的测定技术黄曲霉毒素是一类在紫外线照射下能发出强烈特殊荧光的物质，根据其在波长为 365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为 B、 G两大族，其中 B族毒素发出蓝色荧光，而 G族毒素发出绿色荧光。 B族中有 AFTBl、 B2、 ML、 M2、 B2a、 BM2a、 L、 L-H1、 2， 3-二羟基 Bl、 Bl-2， 3环氧化物、四氢脱氧 - Bl、 1-甲氧基 B2、 2-甲氧基 B2、 1-乙氧基 B2、 1-乙酰氧基 B2、 Q1、 Q2a、 Q1-HS、 B3、 P1； G族中有 AFTGl、 G2、G2a、 GM2a、 1-乙氧基 G2、 GM1等。食品中微生物毒素的测定技术2理化性质黄曲霉毒素的相对分子质量为 312 346，熔点为 200300 。难溶于水，不溶于己烷、乙醚和石油醚，易溶于油、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二甲基甲酰等有机溶剂。一般在中性及酸性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在 pH9 10的强酸溶液中分解迅速，生成几乎无毒的盐，但反应是可逆的。其纯品为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素 B1的分解温度高达 280 ，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。食品中微生物毒素的测定技术3主要产毒菌株黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉（产量较少），它们污染食物后生长繁殖产生的毒素。4.分布黄曲霉、寄生曲霉等霉菌在自然界普遍存在，很容易污染食品，尤其是花生、玉米和核桃。在大豆、稻谷、小麦、通心粉、皮蛋、调味品、牛奶、奶制品、食用油、干咸鱼及辣椒等食品中也经常发现黄曲霉毒素。其污染程度受地区和季节因素以及作物生长、收获、贮存的不同条件影响。表 5-1中列出了世界各地各种食品中黄曲霉毒素存在的情况。 食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术黄曲霉毒素产毒菌株的生长繁殖最适宜的条件是：温度30 38 、相对湿度 80%以上。实验证明，当温度为 28 32、相对湿度在 80%以上时产生 AFT量最高。一般在热带和亚热带地区 AFT的检出率比较高。在中国，华中、华南地区产毒菌株相对较多，产毒量也大，东北、西北地区相对较少。5.毒性黄曲霉毒素能引起人及动物肝脏组织受破坏，严重时，可导致肝癌甚至死亡。 1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO） 的癌症研究机构划定为 I类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。食品中微生物毒素的测定技术在各种黄曲霉毒素中，以 AFTB1的毒性和致癌性最强。比其他化学致癌剂氰化钾还高，比二甲基偶氮苯大 900倍，比二甲基硝胺大 75倍，相对而言 ,AFTG1和 M1的致癌性较弱。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素 B1最为多见，其毒性和致癌性也最强，故食品中污染的黄曲霉毒素含量常以 AFTB1为主要指标。6.限量1995年，世界卫生组织制定的食品中黄曲霉毒素最高允许浓度为 15g/kg。中国政府对食品中黄曲霉毒素的含量有严格规定，国家标准 GB2761规定了黄曲霉毒素在食品中的允许最大浓度，见表 5-2。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒素含量（指 B1+ B2+G1+G2的总量）不能超过15g/kg ， 人类消费的牛奶中的含量不能超过 0 5g/kg， 其他动物饲料中的含量不能超过 300g/kg 。 而欧盟国家规定更加严格，要求人类生活消费品中的黄曲霉毒素 B1的含量不能超过 2g/kg ， 总量不能超过 4g/kg ， 牛奶和奶制品中的黄曲霉毒素 M1含量不能超过 0 05g/kg ， 世界各国及地区对花生及其制品中黄曲霉毒素的最高允许含量见表 5-3。食品中微生物毒素的测定技术食品中微生物毒素的测定技术本节主要介绍食品中黄曲霉毒素 B1、 黄曲霉毒素 B1 B2 G1 G2总量、黄曲霉毒素 M1与 B1的测定方法。二、食品中黄曲霉毒素 B1的测定（一）薄层色谱法 （ TLC）薄层色谱法是中华人民共和国国家标准 GB/T5009.222003 黄曲霉毒素 B1的测定方法中的第一法，此法适用于粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中 AFTB1的测定方法，在此法中，薄层板上 AFTB1的最低检出量是 0.0004g， 检出限为 5g/kg。食品中微生物毒素的测定技术1原理试样中黄曲霉毒素 B1经有机溶剂提取、净化、浓缩，并经薄层分离后，在波长 365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量来测定 AFTB1的含量。2试剂（ 1）试剂 三氯甲烷、正己烷或石油醚（沸程 30 60 或60 90 ）、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚（经无水硫酸钠脱水）、丙酮、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、硅胶 G（薄层色谱用）。苯 -乙腈（ 98+2）混合液：量取 98mL苯，加 2mL乙腈，混匀。甲醇 -水（ 55+45）溶液：量取 55mL甲醇，加 45mL蒸馏水，混匀。食品中微生物毒素的测定技术（ 2） AFTB1标准溶液 AFTB1标准贮备液 用百万分之一的微量分析天平精密称取 11.2mgAFTB1标准品，先加入 2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至 100 mL， 避光置于 4 冰箱中保存。先用紫外分光光度计测定配制的 AFTB1标准贮备液浓度，再用苯 -乙腈混合液调整其浓度为 10g/mL。 在 350nm， AFTB1在苯 -乙腈（ 98:2）混合液中的摩尔消光系数为 19 800。 AFTB1标准使用液 （ 1g/mL） 精密吸取 1.0 mL 10g/mLAFTB1标准溶液于 10mL容量瓶中，加苯 -乙腈混合液至刻度，混匀。此液含 AFTB1为 1g/mL。AFTB 1标准使用液 （ 0.2g/mL） 精密吸取 1.0 mL 1g/mLAFTB1标准应用液 于 5mL容量瓶中，加苯 -乙腈混合液至刻度，摇匀。此液含AFTB1为 0.2g/mL。AFTB 1标准使用液 （ 0.04g/mL） 精密吸取 1.0 mL 0.2g/mLAFTB1标准应用液 于 5mL容量瓶中，加苯 -乙腈混合液至刻度，摇匀。此液含 AFTB1为 0.04g/mL。食品中微生物毒素的测定技术（ 3）消毒液50g/L次氯酸钠溶液 称取 100g漂白粉精，加入 500mL水，搅拌均匀。另将 160g工业用碳酸钠（ Na2CO310H2O） 溶于500mL温水中。再将两液混合、搅匀，澄清后过滤，贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，作为 AFTB1消毒剂。3主要仪器小型粉碎机、分样筛、电动振荡器、全玻璃浓缩器或250mL索氏抽提器、玻璃板（ 5cm20cm ）、 薄层板涂布器、展开槽（内长 25cm、 宽 6cm、 高 4cm）、 紫外光灯（ lOO125W， 带有波长 365nm滤光片）、微量注射器或血色素吸管等。食品中微生物毒素的测定技术4操作步骤（ 1）取样试样中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒可以左右测定结果，而且有毒霉粒的比例小，同时分布不均匀。为避免取样带来的误差，应大量取样，并将该大量试样粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批试样的相对可靠的结果，因此采样应注意以下几点： 根据规定采取有代表性试样。 对局部发霉变质的试样检验时，应单独取样。 每份分析测定用的试样应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至 0.5 1kg， 然后全部粉碎。粮食试样全部通过 20目筛，混匀。花生试样全部通过 10目筛，混匀。或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等试样不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批试样可采取 3份大样作试样制备及分析测定用，以观察所采试样是否具有一定的代表性。食品中微生物毒素的测定技术（ 2）样品预处理（提取、净化与浓缩） 玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等甲法： 称取 20.OOg粉碎过筛试样（面粉、花生酱不需粉碎），置于 250mL具塞锥形瓶中，加 30mL正己烷或石油醚和 lOOmL甲醇 -水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡 30min， 静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇 -水溶液于另一具塞锥形瓶内。取 20.OOmL甲醇 -水溶液（相当于 4g试样）置于另一个 125mL分液漏斗中。食品中微生物毒素的测定技术在第二个分液漏斗中加 20mL三氯甲烷，振摇 2min， 静置分层，（如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷层，经盛有约 10g先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于 50mL蒸发皿中，分液漏斗中再加 5mL三氯甲烷于重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜于 65 水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却 23min后，准确加入 1mL苯 -乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入 lmL苯 -乙腈混合液）。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于 2mL具塞试管中。食品中微生物毒素的测定技术乙法： （限于玉米、大米、小麦及其制品）。称取20.OOg粉碎过筛试样于 250mL具塞锥形瓶中，用滴管滴加约6mL水，使试样湿润，准确加入 60mL三氯甲烷，振荡 30min，加 12g无水硫酸钠，振摇后，静置 30min， 用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于 lOOmL具塞锥形瓶中。取 12mL滤液（相当4g试样）于蒸发皿中，在 65 水浴上通风挥干，准确加入lmL苯 -乙腈混合液，用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于 2mL具塞试管中。食品中微生物毒素的测定技术 花生油、香油、菜油等 称取 4.00g混匀的试样置于小烧杯中，用 20mL正己烷或石油醚将试样转移于 125mL分液漏斗中，用 20mL甲醇 -水溶液分次洗烧杯，洗液一并移人分液漏斗中，振摇 2min， 静置分层后，将下层甲醇 -水溶液移入第二个分液漏斗中，再用 5mL甲醇 -水溶液重复振摇提取一次，提取液一并移人第二个分液漏斗中。在第二个分液漏斗中加入 20mL三氯甲烷，（以下按 “ 甲法 ” 自 “ 振摇 2min， 静置分层 ” 起依法操作）。 酱油、醋、发酵酒类 称取 10.OOg试样于小烧杯中，为防止提取时乳化，加 0.4g氯化钠（发酵酒类不加），移人分液漏斗中，用 15mL三氯甲烷分次洗涤烧杯，洗液并人分液漏斗中。（以下按 “ 甲法 ” 自 “ 振摇 2min， 静置分层 ”起依法操作）。最后加入 2.5mL苯 -乙腈混合液，此溶液每毫升相当于 4g试样。食品中微生物毒素的测定技术或称取 10.OOg试样，置于分液漏斗中，再加 12mL甲醇（以酱油体积代替水，故甲醇与水的体积比仍约为 55+45），用20mL三氯甲烷提取，（以下按 “ 甲法 ” 自 “ 振摇 2min， 静置分层 ” 起依法操作）。最后加入 2.5mL苯 -乙腈混合液。此溶液每毫升相当于 4g试样。 干酱类（包括豆豉、腐乳制品） 称取 20.OOg研磨均匀的试样，置于 250mL具塞锥形瓶中，加入 20mL正己烷或石油醚与 50mL甲醇 -水溶液。振荡 30min， 静置片刻，以叠成折叠式快速定性滤纸过滤，滤液静置分层后，取 24mL甲醇 -水层（相当 8g试样，其中包括 8g干酱类本身约含有 4mL水的体积在内）置于分液漏斗中，加入 20mL三氯甲烷，（以下按 “ 甲法 ” 自“ 振摇 2min， 静置分层 ” 起依法操作）。最后加人 2mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于 4g试样。食品中微生物毒素的测定技术（ 3）测定A 单向展开法 薄层板的制备 称取约 3g硅胶 G， 加相当于硅胶量 2 3倍左右的水，用力研磨 l 2min,至成糊状后立即倒于涂布器内，推成 5cm20cm ，厚度约 0.25mm的薄层板三块。在空气中干燥约 15min后，在 100 下活化2h， 取出放干燥器中保存。一般可保存 2 3天，若放置时间较长，可再活化后使用。 点样 将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加 4个点，点距边缘和点间距约为 lcm， 点直径约 3mm。 在同一块板上滴加样点的大小应一致，滴加时可用吹风机的冷风边点边吹。滴加的 4个样点如下：第一点： lOL 0.04g/mL AFTB1标准使用液。第二点： 20L样液。第三点： 20L样液 +lOL0.04g/mL AFTB1标准使用液。第四点： 20L样液 +lOL0.02g/mL AFTB1标准使用液。食品中微生物毒素的测定技术 展开与观察 在展开槽内加 l0mL无水乙醚，预展 12cm， 取出挥干。再于另一展开槽内加 l0mL丙酮 -三氯甲烷（8+92），展开 l0 12cm， 取出。在紫外光下观察结果，方法如下 :第一点滴加了 l0L 0.04g/mL AFTB1标准使用液，其中含黄曲霉毒素 B1是 0.0004g， 是 AFTB1的最低检出量点。同时，此点还可以检验薄层板好坏和色谱条件是否合适，若展开后此点无荧光，则可能是薄层板未制好，或色谱条件有问题。第三点和第四点的样液点滴加了 AFTB1标准使用液，可使样点中 AFTB1荧光点与 AFTB1标准使用液荧光点重叠。如样液点为阴性，薄层板上的第三点中 AFTB1为 0.0004g， 可用作检查在样液内 AFTB1最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中 AFTB1为 0.002g， 主要起定位作用。在上述色谱条件下， AFTB1的 Rf0.6左右。食品中微生物毒素的测定技术第二点是样点。在与 AFTB1标准点的相应位置（ Rf0.6） 上无蓝紫色荧光点，而其他点均有荧光点，表示试样中AFTB1含量在 5g/kg以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。 确证试验 为了证实薄层板上样液荧光确系由 AFTB1产生的，滴加三氟乙酸，使其与 AFTB1反应，产生 AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值 Rf0.1左右。方法是于薄层板左边依次滴加两个点。第一点： lOL 0.04g/mL AFTB1标准使用液。第二点： 20L样液。于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反 应 5min后，用吹 风 机吹 热风 2min后，使热风吹到薄层板上的温度不高于 40 ，再于薄层板右边滴加以下两个点。 食品中微生物毒素的测定技术第三点： lOL 0.04g/mL AFTB1标准使用液。第四点： 20L样液。再展开（同 ），在紫外光灯下观察样液是否产生与 AFTB1标准点相同的衍生物（ Rf0.1 ）。 未加三氟乙酸的第三点和第四点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。 稀释定量 样液中（ 4g样品 /mL， 点样 20L） 的 AFTB1荧光点的荧光强度如与 AFTB1标准点的最低检出量（ 0.0004g） 的荧光强度一致，则试样中 AFTB1含量即为 5g/kg。 如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少点样量，或将样液稀释后再点样，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。点样形式如下：第一点： lOL 0.04g/mL AFTB1标准使用液。第二点：根据情况点 lOL样液。第三点：根据情况点 l5L样液。第四点：根据情况点 2OL样液。食品中微生物毒素的测定技术 结果计算 试样中黄曲霉毒素 B1的含量按下式进行计算：X=0.0004 （ 5-1）式中：X 试样中 AFTB1的含量， g/kg；Vl 加入苯 -乙腈混合液的体积， mL；V2 出现最低荧光强度时滴加样液样液的体积， mL；D 样液的总稀释倍数；m 加入苯 -乙腈混合液溶解时相当试样的质量， g；0.0004 AFTB 1的最低检出量， g；结果表示到测定值的整数位。食品中微生物毒素的测定技术B 双向展开法如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄