现代色谱分离技术中国海洋大学

现代色谱分离技术中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室李国强 For 博兴京博控股股份有限公司2011-12-20主要内容薄层色谱（ TLC）1柱色谱（ CC）2高效液相色谱（ HPLC）3一 薄 层 色 谱引 言薄层色谱 (Thin Layer Chromato-graphy)，又称 薄层层析 ，常用 TLC表示。将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的表面上均匀的铺成薄层，试样点在薄层的一端，流 动相借毛细作用流经固定相，使被分离的物质展开。固定相： 吸附剂。流动相： 展开剂。分离原理： 吸附与解吸附。薄层板v固定相： 硅胶 为使用最广泛的薄层材料。除此之外还有 氧化铝 、 硅藻土 等。v常用薄层硅胶的特征：硅胶商品名称 黏合剂 荧光添加剂 应用硅胶 H 无 无 薄层色谱，柱色谱硅胶 G 有 无 薄层色谱，柱色谱硅胶 GF254 有 有 在 254nm紫外灯下看荧光薄层板的制备方法湿法：平铺法和涂铺法。制备薄层色谱定性薄层色谱使用目的薄层色谱分类（一）定性薄层色谱点 样 展 开 定位与显色1 点样v样品溶解： 用 甲醇、氯仿、石油醚、丙酮 等挥发性有机溶剂，最好选用与展开剂极性相似的溶剂。v点样工具： 玻璃毛细管，微量点样器。v点样量： 与 薄层的厚度、吸附剂的种类、显色剂的灵敏度 等因素有关，若因样品溶液太稀，可重复点样。v点样位置： 距底边约 1-2cm的起始线上，点与点的距离为 0.5-1cm。v点样方式： 定性分析 -点状 点样。（直径 3-5mm的圆点）制备薄层 -条状 点样。2 展开u石油醚u环己烷u四氯化碳u苯u氯仿u乙醚u乙酸乙酯u丙酮u乙醇u甲醇u水u乙酸极性增强展开剂选用原则1 对所需组分有良好的溶解性（相似相溶）。2 可使成分间分开。3 待测组分 Rf在 0.20.8之间。常用 展开剂体系一元： 石油醚，甲醇 等。二元： 石油醚：丙酮 ， 石油醚：乙酸乙酯，氯仿：甲醇 等。三元： 氯仿：甲醇：水 等。应注意：a 展开剂不淹没样点。b 薄层板呈倾斜状。C 展开过程应在密闭容器中进行。d 展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快标出展开剂前沿位置，以便计算 Rf值。2 展开l展开后将溶剂吹干。l常见的定位方法：3 定位与显色光学检出法 254nm， 365nm（使用方便，被检测物不易被破坏）蒸气检出法 展开剂挥发干净后放入储有晶体碘并充满碘蒸气的密闭容器中，放置一段时间后取出薄层板，标出斑点位置。试剂检出法 利用化学试剂与被测物质斑点在薄层板上发生化学反应通用显色剂： 10%硫酸乙醇、茴香醛、香草醛。(二 )制备薄层色谱（ PTLC）特点：1 较分析薄层样品液的 浓度大 。2 板较 大 ，较 厚 （吸附剂用量多）3 点样多点成 直线 。用于制备的薄层色谱。样品的检测v 有色物质 直接观察斑点。v 荧光物质 紫外灯下观察。v 如必须采用化学试剂显色时，可将薄层板的大部分用另一块玻璃板盖住，留出一条进行显色，将需要的部分作出记号。样品的收集v切割： 用刮刀刮下带有样品的吸附剂。v回收： 将刮下的吸附剂装入玻璃柱中，用极性尽可能低的溶剂洗脱，丙酮和氯仿常用。TLC的特点v方法简便易行 ,价格低廉；v分析快速；v检出灵敏度高；v分离能力强；v检测手段多样化；v应用广泛；二 柱 色 谱柱色谱硅胶柱色谱凝胶柱色谱ODS柱色谱大孔树脂柱色谱(一 )硅胶柱色谱1 原理 ：根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。流动相流过时各组分以不同的速率向下移动，吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现化合物的分离。1 吸附剂的选择硅胶 G 100200目（拌样用）200300目（上柱用）硅胶 H 2 准备工作：2 色谱柱的选择下端有活塞的玻璃柱 柱子大小视分离样品的量而定3 洗脱剂的选择 洗脱剂多一般由一元或二元溶剂按一定的比例配比组成，通过不同的配比调节溶剂系统的极性，较复杂成分常用梯度洗脱。初始洗脱剂配比的选择：薄层试验，使待分离组分的 Rf值介于 0.10.2之间的展开系统可选为柱色谱的洗脱剂。3 操作步骤加样洗脱检测合并装柱 将色谱柱洗净、干燥，底部塞一小块脱脂棉。（ 1）干装法： 将硅胶通过小漏斗倒入柱内，应不间断地形成一细流慢慢加入柱内，同时用橡皮槌轻轻敲打色谱柱，使装填均匀。柱装填好后，打开下端活塞，从上端倒入洗脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保留一定液面。（ 2）湿装法： 将硅胶加入适量最初使用的洗脱剂，超声搅拌，调成混悬液，打开柱子下端活塞，徐徐将混悬液倒入柱子，使洗脱剂慢慢流出，带动硅胶缓慢沉于柱的下端。待加完吸附剂后，继续使洗脱剂流出，直到硅胶的沉降不再变动。注意整个操作过程要慢慢进行，不要将气泡压入硅胶中，而且要 始终保持吸附剂上端有溶剂，切勿流干 。最后在硅胶上面加少许棉花，将多余洗脱剂放出至上面保持有 1cm高液面为止，关上活塞。装柱洗脱检测合并加样3 操作步骤多采用干法加样（拌样法）： 将样品用尽量少的易挥发溶剂溶解，加入样品约 5倍量的硅胶拌匀，置空气中挥尽溶剂，或在旋转蒸发器里于适温下蒸干，研匀后均匀置于装好硅胶的柱顶，尽量使样品平整，并在柱顶放一块圆形滤纸。装柱加样洗脱检测合并3 操作步骤将通过 TLC选择好的洗脱剂加入分液漏斗或者加液球中，使之不断缓慢加于样品之上，注意始终保持洗脱剂液面在硅胶之上，切勿流干。打开色谱柱下端活塞，控制流速，等份收集洗脱液，也可用自动收集器收集。通过上端加压或者下端减压可以提高洗脱速度，但是可能会降低塔板数影响分离效果。装柱加样洗脱检测合并3 操作步骤每份洗脱液采用薄层色谱法检查。装柱加样洗脱检测