第17章液相色谱法

第十七章高效液相色谱法17.1 概述17.2 高效液相 色谱 仪17.3 高效液相 色谱 法 的分类17.4 高效液相 色谱 法 的应用1课程引入： 食品中苏丹红事件？ 水果、蔬菜中的有机磷农药残留？ “三鹿奶粉事件 ”中三聚氰胺的分析？217-1 概述高效液相色谱法的特点：高压、高效、高速、高灵敏度。适用于高沸点、热不稳定及生化试样的分析。317-2 高效液相色谱仪液相色谱仪（ 1）4液相色谱仪（ 2）5液相色谱仪（ 3）6液相色谱仪（ 4）7一、流程及主要部件1.流程HPLC与 GC的原理相同，只因 HPLC流动相为液体，Van.Deemter方程中，组分的纵向扩散可忽略。89GC和 HPLC在分离上的主要区别：GC：流动相为惰性气体，分离主要取决于组分分子与固定相间的作用力，主要通过改变固定相来改变对组分的选择性。GLC中，流动相对组分作用极弱，一定柱温下，固定液流失主要由高柱温造成其自身挥发，所以，在应用中主要采用涂渍的方法制备柱子。GSC中，无固定液流失现象。10HPLC： 流动相与组分分子间有一定的亲和力；分离是由组分、流动相和固定相三者相互作用的结果。流动相是极性不同的有机溶剂或缓冲水溶液，溶解能力强。在 HPLC中，固定液分子必须键合在填料上，否则，流失严重。另外，填料的颗粒直径一般为 3 5m，柱子制备复杂。因此，在应用中，主要以改变流动相来调节分离的选择性。11高效液相色谱仪一般可分为 4个主要部分：高压输液系统进样系统分离系统检测系统还配有辅助装置：梯度淋洗自动进样数据处理等122.主要部件(1)高压输液泵 压力： 150 350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的 固定相（ 10m， 常用 35m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。13高压输液泵的种类： 恒压泵 液压隔膜泵和气动放大泵。 恒流泵 螺旋注射泵和往返柱塞泵。14（ 2）梯度淋洗装置HPLC有等梯度洗脱和梯度洗脱两种。前者保持流动相组成、配比恒定。后者采用两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按照程序连续改变流动相的浓度配比及极性。梯度淋洗的作用： 提高分离度缩短分析时间提高分析精度15梯度淋洗的方式： 内梯度 高压梯度装置（目前广泛采用）利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。（ 先加压后混合 ）16 外梯度 低压梯度装置通过比例调节阀 ,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例混合后，再用一台高压泵输入色谱柱中。（ 先混合后加压 ） HPLC 梯度淋洗改变的是流动相的配比和极，提高分离效果，缩短分离时间，改善峰形。通过改变流动相的配比和流速是 HPLC中改进分离效果重要手段。GC 程序升温，改变的是分析过程中的柱温。 17(3)进样装置分为手动进样（进样器进样和阀进样）和自动进样（自动进样器进样）两种。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。18(4) 高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径 1 6 mm， 柱长 5 40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。常用：长度为 10 25cm，内径为 4 5mm。19(5) 高效液相色谱检测器 紫外光度检测器（ UV）最常用的检测器，可用于梯度洗脱。如固定波长型的汞灯 254nm或 280nm的紫外检测器、可调波长的氘灯或氢灯 (200-400nm)。不锈钢池 10L。 对 UV无吸收的组分不响应；对 UV吸收较大，如苯不可作流动相。20 光电二极管阵列检测器（ DAD）为新型的紫外吸收检测器。以氘灯为光源，绘制出随时间变化的光谱吸收曲线（ A ）计算机快速处理，可获得分离组分的三维彩色谱图，得到更多信息。2122 示差折光率检测器（ RID） 通用型。每种物质具有不同的折光指数，可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。23 荧光检测器（FD） 选择性检测器高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素 B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸等化合物有响应。2417-3 高效液相色谱法的类型一、影响液相色谱分离的因素高效液相色谱中 , 速率方程中的分子扩散项 B/u较小，可以忽略不计。H = A + C u Dm10-4 10-5Dg25影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。 无随 u降低 H升高的现象 （ B/u） u降低， H降低，但无 Hmin u升高， H平缓升高。因 Dm10-4 10-5Dg261.流速 流速大于 0.5 cm/s时 , H u曲线是一段斜率不大的直线。 降低流速，柱效提高不是很大。 但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。272.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度。研制高效柱填料是一活跃领域。283.流动相及流动相的极性 可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 亲水性固定液常采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称 正相柱 。 适合极性化合物分离。29 若流动相