第七章蛋白质分分离纯化和表征09

1蛋白质的分离、纯化和表征第 7 章P291一、蛋白质的酸碱性质蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有 两性解离性质 的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的 pH有关， pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少； pH升高，则解离情况相反。 在特定 pH条件下，某种蛋白 质 分子所 带 正 负电荷相等，静 电 荷 为 零， 这 一 pH 称 为该 蛋白 质 的等 电 点（ pI）。蛋白质的等电点 有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如 Ca2+、 Mg2+、 Cl-、等可与蛋白质某些可解离基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液pH称为等离子点 (isoionic point,或称等离点 )。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。几种蛋白质等电点二、 蛋白质的分子大小与分子量的测定蛋白质的分子量的 范围 :6103 1106 Da（一）根据化学组成测定最低相对分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为 0.335%,计算二者的相对分子质量。最低相对分子量 x 100 =铁的百分含量 铁的原子量 0.335 55.8 x 100 =16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的 aa，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。（二）渗透压法测定相对分子量渗透压法测定 Mr操作简单， Mr在 10-100 kDa时较准，但不能区别蛋白质分子是否均一 。渗透压公式： Mr = RTlimc0c(c=质量浓度， g/mol)（三）沉降分析测定 Mr 超速离心机最大 转 速 : 60000 80 000r/min, 相当于位于距 转轴 中心 10 cm处 、 单 位 质 量 (1g)分子所受到的离心力(离心 场 强 度 )为 400 000 g 700 000 g. 沉降速度与蛋白 质 分子大小、密度和形状有关 ,且与溶 剂密度和黏度有关 . 单 位离心 场 强 度的沉降速度称 为 沉降系数 , 用 s(小写 )表示 :蛋白 质 、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于 11013到 20010 13秒之 间 。 为 了使用方便，以 10 13秒 为 一个沉降系数的 单 位，称 为 斯 维 得 贝 格 单 位（ Svedberg unit），或称沉降系数 单 位，用 S表示。如人血 红 蛋白的 S为 4.4610 13秒，即 4.46S。 蛋白质的沉降系数 (s)与相对分子质量 (Mr)的关系可用斯维得贝格方程表达 :摩尔气体常数 (8.314JK-1mol-1); 热力学温度 (K),旧称绝对温度蛋白质的扩散系数 (cm2/s), 数值上等于当浓度梯度为 1个单位时在 1 s内通过 1 cm2面积的蛋白质质量溶剂的密度 (g/cm3)偏微比体积 (cm3/g) 又称偏微比容 ,蛋白质溶于水的偏微比容约 0.74 cm3/g沉降系数（四）凝胶过滤法测定 Mr凝胶过滤 （层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术 ， 同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关 :先测得几种标准蛋白质的Ve （ Ve为洗脱体积） ，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测V测（五） SDS-PAGE法测定 Mr聚丙烯酰胺凝胶电泳 具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当 电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。 SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用 , 巯基乙醇能打开二硫键 , SDS和巯基乙醇存在下 ,单体蛋白或亚基 (寡聚蛋白质解离成亚基 ) 处展开状态 . SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体 . 在一定条件下 , SDS与大多数蛋白质的结合比 : 1.4g SDS / 1 g蛋白质 ,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子 SDS. SDS 与蛋白质结合后 : 第一 , SDS 阴离子使多肽链覆盖上相同密度的负电荷 , 远超过蛋白质原有电荷量 , 掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别 ; 第二 , 改变蛋白质的天然构象 , 使大多数蛋白质采取类似的形状 . 因此在 SDS 存在下的电泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的 .聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE）SDS-PAGE，迁移率不受蛋白质原有的电荷、分子形状等因素影响 , 但凝胶具分子筛效应 . 因此，迁移率与相对分子质量 (Mr)之关系 :常数 相对迁移率：样品迁移距离/前沿 (染料 )蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素： 双电层 水化层三、胶体性质与蛋白质的沉淀1蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围 (1-100nm)。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。 盐析法（ salting out） ：中性盐（ NH4SO4， NaSO4， NaCl等） 蛋白质脱去水化层。 优点：不引起蛋白质变性。盐溶（ salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增加的现象。2蛋白质的沉淀 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮） 脱去水化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用。条件：低温操作，缩短时间。 重金属盐沉淀法 :当溶液 pHpI,蛋白质颗粒带负电荷 ,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等 ) 生成沉淀。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 :生物碱试剂 能引起生物碱沉淀的一类试剂。 当溶液 pHpI时 ,蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂 ,酸根负离子反应 沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质 加热变性沉淀法原因：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层用途：制豆腐（加热 +少量盐卤）四、 蛋白质分离纯化的一般原则前处理：细胞破碎粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等细分级分离：层析、电泳、结晶 蛋白质纯化测总目标：增加 纯度或比活力 动物材料剔除结缔组织、脂肪组织 ; 种子材料应先去壳和种皮以免受单宁等物质的污染 , 油料种子脱脂 . 选择适当方法 ,破碎组织或细胞：动物组织 (电动捣碎机或匀浆器或超声 ); 植物组织 (英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用 纤维素酶 ); 细菌细胞 (超声 ,与砂研磨或 溶菌酶 ). 选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来 . 如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的 , 用超声波或去污剂使膜结构解聚 , 用适当的介质提取。前处理 :五、 蛋白质分离纯化的 一般方法 根据分子量：如沉降速度法离心 根据密度：沉降平衡法离心 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据分子量和分子形状：凝胶过滤 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀 根据电荷：等电点沉淀透析 ：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析 。超过滤 ：是利用压力或离心力，强行使水和其他小 分子而 蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。（一）根据分子大小不同的分离纯化方法磁力搅拌器透析液装有蛋白溶液的透析袋搅拌子透析 超滤 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自的区带。 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。密度梯度（区带）离心常用于生成密度梯度的介 质 是蔗糖、聚蔗糖（ Ficoll），分离核酸 时还 常用 CsCl作 为介 质 。凝胶过滤法 常用凝胶：交联葡聚糖、 聚丙 烯酰 胺凝胶， 琼 脂糖（ sepharose 或 Bio-Gel A）； 凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外，即分 级分离范围或排阻极限 ; 大分子从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小。小分子在颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大； 用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定蛋白质分子量；（二）利用溶解度差别的纯化方法影响 蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的 pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构 。1. 通 过 改 变 溶液 pH值 的等 电 点沉淀法2. 通 过 改 变 溶液离子 强 度的 盐 析、 盐 溶3. 有机溶 剂 的分 级 沉淀4. 通 过 改 变 温度的沉淀法在等 电 点 pH条件下，蛋白 质为电 中性，其物理性质 如 导电 性、溶解度、黏度、渗透 压 等都表 现为 最低值 ，易 发 生絮 结 沉淀。因此，等 电 点性 质 常被用于蛋白 质 的分离制 备 ，被称 为 等 电 点沉淀技 术 。等 电 点沉淀盐溶与盐析 盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为 盐溶 ； 盐析 :当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为 盐析 ; 同一浓度盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 盐溶原理 :蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。 盐析原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出温度对蛋白质溶解度的影响0-40 之 间 ，大部分球状蛋白 质 的溶解度随温度的升高而增加。有机溶剂分级分离法 降低水溶液的介电常数，破坏大分子周围水膜，使溶质溶解度降低 ; 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，有机溶剂沉淀法。经常使用的