第二章染色体与dna3复制

学习目的和要求熟悉 DNA复制的一般规律，掌握 DNA复制的特点；掌握真核生物和原核生物 DNA复制的异同点；理解 DNA复制的基本过程。 二、 DNA的复制与调控（教材 P.37-51）1、 DNA复制的半保留性全保留复制模型(conservative replication model）两条母链彼此结合，恢复原状，新合成的两条子链彼此互补结合形成一条新的双链。 （一） DNA复制概况分散模型 (dispersive model)亲代双链被切成双链片段，而这些片段又可作为新合成双链片段的模板，新、老双链片段又以某种方式聚集成 “ 杂种链 ” 半保留复制模型(semiconservative replication model）DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代 DNA分子中一条链来自亲代 DNA， 另一条链是新合成的。 半保留复制的实验证据 （ Meselson 和 Stahl， 1958）复制叉与复制泡从打开的起点向一个方向形成一个的叉形或 Y形 从打开的起点向两个方向形成 复制开始时，双链打开2、 DNA复制的半不连续性前导链RNA引物岗崎片段 随从链 原核：1000-2000bp真核：100-200bp 依 DNA合成的起始方式，复制可分为 从新起始与 共价延伸 两种类型。前者是前导链从新开始，也叫复制叉式复制；后者是先导链共价结合在一条亲代链上，也叫滚环式复制。 （二） DNA复制的几种主要方式1、复制叉式复制复制叉式复制是真核生物和原核生物中普遍存在的DNA复制方式。滚环式复制是单向复制的特殊方式，是某些噬菌体DNA复制的共同方式。另外某些双链 DNA的合成也通过滚环复制的方式进行。2、滚环式复制（ 1） 滚环复制（ 2）噜噗滚环复制（ looped rolling circle replication）（ 3）线粒体 DNA的 D-噜噗 (displacement loop)复制(4) 型DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段第一阶段为 DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成；第二阶段为 DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段；第三阶段为 DNA复制的终止阶段。在 DNA复制的整个过程中需要 30多种酶及蛋白质分子参加（三） DNA复制的过程（ 1） DNA复制的起始点 (origin of replication)：复制起始的特定 DNA序列 复制起点的一般特征：1、它们都由多个独特的短重复序列组成；2、这些短重复序列被亚多基的复制起点结合蛋白所识别；它对于在复制起点组装复制酶具有关键作用；3、复制起点附近一般有一个富含 A-T的序列，以利于双螺旋 DNA解链或解旋，并产生单链 DNA复制模板。 复制子或复制单元 （ replicon）：染色体上能够进行独立复制的单位。细菌一个复制子，真核生物一条染色体上多个复制子。1、 DNA复制的起始阶段 定点开始双向复制原核生物和真核生物 DNA复制最主要的形式 定点开始单向复制质粒 colE1（ 2） DNA复制的方向 两点开始单向复制腺病毒 DNA的复制 解链酶 (helicase) （ 3） DNA复制起始、引发体的形成及所参与的酶和蛋白质 DNA复制、修复、重组及接合过程，两条互补链必须部分分开形成单链 DNA中间体 -解旋 -螺旋酶催化 发动蛋白，具有依赖 DNA的ATPase活性，把 ATP水解产生的自由能转化为解旋 DNA并使螺旋酶本身沿 DNA链移动的机械能 500-1000bp/秒 真核生物转录复合物的组分，有些螺旋酶具有 RNA螺旋酶活性 单链结合蛋白 (single strand binding proteins, SSBP)又称为双螺旋去稳定蛋白（ helix destabilizingprotein）由 177个 aa组成在 E.coli 中以四聚体存在分子量为 74KDa在原核中 SSB与 DNA结合表现出协同效应。A. SSB之间的相互作用；B. 第一个 SSB和 DNA的结合改变了 DNA的结构。 引发体的形成A. 引物酶 (primase)B. 引发体 (primosome)（ 1） DNA的聚合反应和 DNA聚合酶2、 DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子DNA聚合酶的共同特点第一，需要提供合成模板；第二，不能起始新的 DNA链，必须要有引物提供 3 OH；第三，合成的方向都是 5 3第四，除聚合 DNA外还有其它功能 DNA聚合酶 IDNA pol 是由一条多肽链组成，分子量为 109KD。酶分子中含有一个 Zn+，是聚合活性必须的。 DNA聚合酶有 6个结合位点： 模板结合位点； 引物结合位点； 引物 3 OH结合位点； 底物 dNTP结合位点； 53 外切酶结合位点； 35 校正位点 。DNA聚合酶 的功能A. 53 聚合活性 图 DNA聚合酶催化的 DNA链延长B. 35 外切活性C. 53 外切活性 切口平移（ nick translation）； 链的置换； 模板转换（ template-switching）缺刻平移标记 DNA探针D. 内切酶活性大肠杆菌 DNA聚合酶 的 Klenow片段（ E.coliDNA Pol Klenow fragment），又叫做 Klenow聚合酶或 Klenow大片段酶。它是由大肠杆菌 DNA聚合酶 全酶，经枯草杆菌蛋白酶（一种蛋白质分解酶）处理之后，产生出来的分子量为 76KD的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有 5 3 的聚合活性和 3 5核酸外切酶活性，但失去了全酶的 5 3 的核酸外切酶活性。在 DNA分子克隆中， Klenow聚合酶的主要用途有：（ i）修补经限制酶消化的 DNA所形成的 3 隐蔽末端；（ ii）标记 DNA片段的末端；（ iii） cDNA克隆中的第二链 cDNA的合成；（ iv） DNA序列测定。Klenow片段 分子量 120KD 100个酶分子 /细胞 活性是 DNA pol I的 5% 具有 53 聚合活性和 35 外切活性 没有 53 外切活性 与 DNA修复有关 DNA聚合酶 II DNA复制过程中起主要作用的酶 由一个多亚基组成的蛋白分子 DNA聚合酶 III大肠杆菌 DNA聚合酶特征DNA聚合 酶 DNA聚合 酶 DNA聚合 酶 分子量 109KD 120KD 600KD每个 细 胞中的分子数 400 17-100 10-2053 聚合活性 + + +37 转 化率核苷酸数 酶 分子 分 钟 600 30 30,00053 外切活性 + - -35 外切活性 + + +切刻平移活性 + - -对 dNTP亲 和力 低 低 高功能 修复 不 详 复制去除引物 填 补 空缺 拓扑异构酶 (topoisomerase)上一堂课已经介绍过。(2)与超螺旋松驰有关的酶表 大 肠 杆菌和真核生物中的拓扑异构 酶 类 型 作用 对 超螺旋的作用 型拓扑