第12章核酸与核苷类药物

第一节、概述 第二节、核酸类药物的生产第 12 章 核酸与核苷类药物第一节 概述一、基本概念 核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷或者碱基 天然的、类似物、衍生物及其聚合物 作用：影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢 用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病毒病 核酸是一种多聚体大分子，它的组成单元是 核苷酸 ，将核苷酸中的磷酸基团去掉，剩余部分称核苷，核苷进一步分解可生成戊糖和 碱基 。胰核酸酶 胰、肠核苷酸酶核苷酶嘌呤核苷酸GMPAMP嘧啶核苷酸的结构核酸类药物分类 具有天然结构的核酸类物质 如： ATP、 GTP、 CTP、 UTP、 IMP、 CoA、 CoI(NAD+) 、 CoII(NADP+) 。 这类药物有助于改善 物质代谢 和 能量平衡 ， 修复受损组织， 促使缺氧组织恢复正常生理机能 。 临床上广泛用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩等的治疗 。 这些药物多数是生物体自身能够合成的物质，在具有一定临床功能的前提下，毒副作用小，它们的生产基本上都可以经微生物发酵或从生物资源中提取。 ATP： 用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及动脉或冠状动脉硬化、肝炎等的治疗或辅助治疗。 肌苷 (IMP)：用于急慢性肝炎、肝硬化、白细胞减少、血小板减少等。核酸类药物分类 自然结构核酸类物质的类似物和聚合物 它们是当今人类治疗 病毒、肿瘤、艾滋病 的重要药物，也是产生 干扰素、免疫抑制剂 的临床药物。 主要有叠氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。他莫昔芬扰雌激素的某些活动 ,模拟其它雌激素作用 .用于治疗某些乳腺癌和卵巢癌 . （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸1、酶解法制备 脱氧核苷酸桔青霉 产生 5-磷酸二脂酶红酵母 产生 3-磷酸二脂酶二 、核苷酸的生产方法2、酶解法制备 戊糖核苷酸 我国从 60年代开始使用核酸酶 P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中 60% 是使用酶解法生产的。酶解法生产 5-单核苷酸工艺流程3菌体自溶法生产核苷酸磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的 RNA可产生 5-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产 5-核苷酸。菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：4碱水解法生产 2,3-混合核苷酸RNA结构中的 磷酸二酯键 对于 碱 性条件不稳定 ,很容易生成 2,3-环状磷酸酯 ,此环状磷酸酯对 碱 更不稳定 ,很易加水分解生成2,3-混合核苷酸 。取 RNA配成 3 3.5% 的水溶液 ,加氢氧化钠达 0.3mol/L浓度 ,升温至 38 ,保温 16 20小时 ,用 6mol/L盐酸中和至 pH7.0,从 RNA水解成 2,3-核苷酸的降解率达 95以上 ,将2,3-混合核苷酸制成每片含 50 100mg的片剂 ,经临床使用 ,对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。（ 二）发酵法生产核苷酸1发酵法生产肌苷酸（ IMP）2、 发酵生产黄苷酸（ XMP） 及酶法转化成鸟苷酸IMP生成总反应过程 SAMP合成酶 IMP脱氢酶 SAMP裂解酶 GMP合成酶AMP和 GMP的生成SAMP黄苷酸肌苷酸 肌苷酸肌苷酸（三）半合成法制备核苷酸 (略 )由于 发酵法生产核苷 的产率很高， 核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成 5-核苷酸收率可达 90% 。 例一：肌苷 2mmol/L悬浮于 5ml磷酸三乙酯中，温度控制 0 ，添加氯化氧磷 6mmol/L， 水 2mmol/L， 反应 2h， 5-IMP摩尔产率达 91。 例二：鸟苷 2mmol/L悬浮于 5ml磷酸三甲酯中，温度控制 0 ，添加氯化氧磷 6mmol/L， 水 2mmo/L， 反应 6h， 5-GMP摩尔产率达 90% 。第二节 核酸类物质的生产一、 RNA的提取与制备1. RNA的工业来源从微生物中提取 RNA， 是工业上最实际和有效的方法，一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源。 通常在细菌中 RNA占 5 -25，在酵母中占 2.7 15，在霉菌中占0.7%28%, 面包酵母含 RNA4.1 7.2。 2. 高 RNA含量酵母菌体的筛选酵母菌体收率高，易于提取 RNA 。可以 从自然界筛选 并可用 诱变育种 的方法提高酵母的 RNA含量。 发酵法生产高含量RNA酵母及其 RNA提取工艺流程见图 2. RNA提取实例二、 DNA的提取与制备DNA， 可以促进细胞的活化，调节新陈代谢，延缓机体衰老，维护正常免疫功能有积极的作用 。1工业 用 DNA的提取从 冷冻鱼精 中提取。 鱼精中主要含有 核蛋白 、 酶类以及多种微量元素 。 核蛋白的主要成分是脱氧核糖核酸 (DNA)和碱性蛋白质 (鱼精蛋白 )，其中 DNA 占大约 2 3。2具有生物活性 DNA的制备可从 动物内脏 （肝、脾、胸腺）中提取制备，操作条件 0 3 。动物内脏加 4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎 1分钟，匀浆于 2500rpm离心 30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀悬浮 于 20倍量的冷生理盐水中， 再捣碎 3分钟，加入 2倍量 5十二烷基磺酸钠，并搅拌 2 3小时，在 0 2500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷乙醇，离心即可得纤维状 DNA， 再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品 DNA。三、核苷类药物的制备发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点： 它们都使用 磷酸单酯酶 活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌为诱变出发菌株； 它们都是通过使用物理或化学 诱变 方法选育出在遗传性状上具有特定 标记 的诱变菌； 它们在发酵培养时必须提供 限量的生长因素 ，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。ADPAMP GMPGTPGDPSAMPIMP XMPAMP脱氨酶 IMP脱氢酶GMP还原酶SAMP合成酶PRPPAICARSAICARPRPPATPSAMP裂解酶 GMP合成酶 在右边的合成途径中，嘌呤核苷酸生物合成的第一个酶 PRPP转酰胺酶 受 AMP、 ADP、以及腺嘌呤衍生物的强烈抑制而受鸟嘌呤衍生物的抑制很弱。 IMP脱氢酶受最终产物 GMP及鸟嘌呤衍生物反馈抑制，SAMP合成酶受 AMP反馈抑制的。 枯草杆菌的腺嘌呤缺陷型，当培养基中提供限量腺嘌呤时就累积肌苷。 而枯草杆菌的腺嘌呤、黄嘌呤缺陷型，当培养基中提供限量鸟嘌呤时就累积腺苷。枯草杆菌的嘌呤核苷酸合成途径PRPP转酰胺酶强 弱生产菌株：（ 1）酶 6、 7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累 IMP-肌苷 （肝炎辅助药）；（ 2）酶 4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累 XMP-黄苷 ；（ 3）酶 5缺失积累 鸟苷 。 肌苷生产菌（ AJ11102） 遗传性状 ：（菌种见 P197） 腺嘌呤缺陷型（ A-）； GMP还原酶缺失 （ GMPred-）； 磺胺脒抗性（ SGr）； 精氨酸缺陷型（ Arg-）。 选育出从遗传上解除正常代谢控制的理想菌株。肌苷产率达 20g/L.（一）发酵法生产肌苷（ I或Iou） 碳源为葡萄糖；保证充足的氮源（肌苷高的含 N）； Mg+、Ca+有促进作用； 最适发酵温度为 30-34 ， pH6.06.2 ；需大风量 ,高溶氧和低 CO2（二）聚肌胞苷酸（聚肌胞） (略 )1、结构与性质1967年美国人 Field发现聚肌胞是 干扰素 诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于0.85氯化钠溶液。2、生产工艺70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下： 1）底物 5-核苷二磷酸吡啶盐的制备（ P199）（ 3）固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。3） Poly I： C制备（ 1）底物预处理： CDP吡啶盐转成锂盐， IDP转成钠盐。（ 2）酶促反应： （每毫升反应液含 mol L数） IDP或 CDP 15； Tris 150； MgC126； 2） 固定化多核苷酸磷酸化酶的制备EDTA 1； 聚合酶 5单位，