色谱知识介绍

HPLC色谱知识及应用 反相分配色谱 极性 :固定相 流动相固定相 - 极性流动相 (己烷 , 庚烷 )- 非极性极性 物质后出峰正相色谱20%反相色谱80%正相 &反相色谱 硅胶基质 - pH 38 Al2O3 . nH2O - pH114 聚合物基质 - pH114高或低 pH下 , 硅胶会溶解化学修饰困难孔结构复杂 , 孔径不均匀导致柱效不够高 , 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损柱填料基质硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸 填料床的长度和内径颗粒形状 球型或不规则型粒径 平均颗粒直径 , 通常 3-10m表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和 , 以 m2/gram表示孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸 , 范围 80-300 色谱柱物理性质C-18柱 -性能影响因素键合类型 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连碳覆盖率 键合相的键合量常用含碳量 (C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。封端 键合步骤之后 , 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来色谱柱化学性质C-18柱 -性能影响因素A类硅胶Original ZORBAX SIL (1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高 (硅羟基的 pKa低 ), 导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶 (高纯 )ZORBAX Rx-Sil (1987)由于金属含量低 , 硅羟基 pKa高 , 碱性化合物不发生拖尾C-18柱 -性能影响因素色谱柱尺寸 - 对色谱分离的影响 短柱 (15-100mm) - 运行时间短 , 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高 , 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高C-18柱 -性能影响因素颗粒形状 - 对色谱分离的影响 当使用黏度较大的流动相 50:50=MeOH:H2O时 , 球型颗粒可以降低柱压 , 延长色谱柱寿命C-18柱 -性能影响因素球形 不规则形粒径 - 对色谱分离的影响 较小的颗粒柱效较高 , 但会引起柱压过高 . 3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品 , 而组份单一的样品多采用 5m的粒径1.8m 3.5 5m 7m 10m 表面积 - 对色谱分离的影响 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力 , 柱容量和分离度 . 表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态 , 对于梯度淋洗尤为重要C-18柱 -性能影响因素孔径 - 对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间 , 达到充分分离 , 改善峰形样品 MW 4, 000, 选择 80 的孔径样品 MW 4, 000, 选择 300 的孔径键合类型 - 对色谱分离的影响 单齿键合：提高传质速率 , 加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性 , 增加色谱柱的载样量C-18柱 -性能影响因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO碳覆盖率 - 对色谱分离的影响 高碳覆盖率：提高分辨率 , 分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间封端 - 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品 , 未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异C-18柱 -性能影响因素固定相键合二甲基硅烷封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3Si RCH3CH3SiCH3CH3Si RCH3R = C8, C18, etc.OOHOHOCH3Si RCH3CH3Si RCH3+ + ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3Cl RCH3(TMS)传统键合及封端技术 键合相种类* 化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。极性键合相两种。* 极性键合相：氰基极性键合相：氰基 (-CN)、氨基、氨基 (-NH2)和二醇和二醇基基 (DIOL) 常用作正相色谱，极性强的组分常用作正相色谱，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。的固定相。* 非极性键合相：各种烷基非极性键合相：各种烷基 (C1C18)和苯基、苯和苯基、苯甲基，极性弱的组分保留值较大甲基，极性弱的组分保留值较大 。HPLC-色谱柱与 pH的关系StableBond C18 pH 18 Bonus-RP pH 29 Extend C18 pH 211.5 Eclipse XDB C18 pH 29 （可用于 100%全水相）未封端双封端三封端双封端HPLC-保留值与 pH的关系pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱： Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm, 5um流动相： 27%甲醇： 73%磷酸pH 2.5 & 2.6温度： 500C流速： 1.0mL/min.邻 氯苯胺（ pKa 2.636)1 2346 750 1 2 3 4 5 6Time (min)0 1 2 3 4 5 61 234675Time (min)pH 7.00pH 7.25色谱柱 : ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 75 mm, 3.5 m流动相 : 44% 25 mM磷酸 , pH 7.00 : 56% 甲醇流速 : 1.0 mL/min 温度 : 25C 检测 : UV 250 nm 可电离的组份的分离可能会随 pH变化发生显著变化 甚至很小的 0.050.25 个 pH变化单位 .样品 : 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol (游离碱 pka 9.5） 7. ibuprofenHPLC-保留值与 pH的关系0.25 个 pHHPLC-保留值与 pH的关系pH变化：0.2个 pH(7.07.2)保留时间改变：1.2分钟 (13.614.8分钟 )保留时间随 pH改变不明显保留时间随 pH改变不明显 (酸性环境中 )（ PKa： 2.98）（ PKa： 10.1）保留时间酸性组份中性组份碱性组份方法稳定区 方法波动区 (pKa+1.5) 方法稳定区 HPLC-保留值与 pH的关系复杂组分的流动相 pH选择技巧色谱柱 : ZORBAX Extend-C184.6 x 150 mm, 5 mm 流动相 : 30% 缓冲液 : 70% MeOH pH 7 缓冲液 20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速 : 1.0 mL/min 温度 : RT 检测器 : UV 254 nm0 512, 345Time (min)76Extend-C18pH 71. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4. Doxylamine 抗敏安 (多西拉敏 ) pKa 9.2 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺 pKa 9.1 6. Triprol内径 ine 苯丙烯啶 pKa 6.5 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0Extend-C18pH 110 5 101234Time (min)657高 pH下 , 碱性成分的保留增加待测物 pKa+1.5以外的流动相 pH可保证方法的稳定性样品溶剂溶解强度 样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰色谱柱 : ZORBAX StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相 : 82% H2O : 18% ACN进样体积 : 30 mLA.样品溶剂100% 乙腈0 10Time (min)12 B.样品溶剂流动相0 10Time (min)12样品 : 1. Caffeine (咖啡因 ) 2. Salicylamide (水杨酰胺 )中性分析时为何要使用缓冲液？色谱柱 : ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相 : 44% A : 56% 甲醇流速 : 1.0 mL/min 温度 : 25C 检测 : UV 250 nm 含缓冲液的流动相可改善保留 , 分离和色谱峰峰形 .样品 : 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranolol 7. ibuprofenA = pH 7.0水 A = pH 7.0 水 +25 mM 磷酸缓冲液0 1 2 3 4 5Time (min)12346750 1 2 3 41, 4, 6, 7235Time (min)0 2.5 5.0 7.5Time (min)1234560 2.5 5.0Time (min)123 456增加缓冲液浓度减少拖尾色谱柱 : ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 150 mm, 5 mm流动相 : 40% 磷酸盐缓冲液60% ACN流速 : 1.5 mL/min.温度 : 40CUSP Tf1.1.622.1.653.1.634.1.775.1.836.1.1210 mM 磷酸盐pH 7.0 USP Tf1.1.412.1.503.1.334.1.395.1.366.1.0025 mM 磷酸盐pH 7.0 在中等 pH下 , 离子强度较高 , 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾样品 : Tricyclic Antidepressants（ 三环抗抑郁剂）1. Desipramine（ 脱甲丙咪嗪）2. Nortriptyline（ 去甲替林）3. Doxepin（ 多塞平）4. Imipramine（ 丙咪嗪）5. Amitriptyline（ 阿米替林）6. TrImipramine（ 三甲丙咪嗪）三乙胺对碱性成分峰形的影响0 2.5 5.0Time (min)12345色谱柱 : ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相 : 85% 25 mM Na2HPO4 : 15% ACN 流速 : 1.0 mL/min. 温度 : 35CUSP TF 5%1. 1.29 2. 1.333. 1.634. 2.355. 1.57No三乙胺10 Mm三乙胺 USP TF 5%1. 1.192. 1.183. 1.204. 1.265. 1.14Time (min)0.0 2.5 5.035421 pH 7样品 :1. Phenylpropanolamine （ 去甲麻黄碱） 2. Ephedrine（ 麻黄素）3. Amphetamine（ 苯丙胺） 4. MethAmphetamine（ 脱氧麻黄碱）5. Phenteramine （ 苯丁胺）竞争酸对酸性组分的峰形的影响色谱柱 : ZORBAX StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm流动相 : 40% A: 60% ACN流速 : 1.0 mL/min.温度 : 室温样品 : Ibuprofen（ 异丁苯丙酸） pKa 4.4pH 35 mM NaH2PO4Tf = 1.8pH 35 mM NaH2PO41% 乙酸pH 2.55 mM NaH2PO40.1% 三氟乙酸Tf = 1.0 Tf = 1.09A: 乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中 三氟乙酸由于所需浓度较低 , 可作为首选液相分析 -小诀窍1. 提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）2. 减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）3. 缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）4. 减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）5. 使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）6. 使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）7. 使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）8. 改变流动相 pH ，可增加柱效（提高灵敏度）9. 改变有机相 % ，可增加柱效（提高灵敏度）10. 改变键合相 ，可增加柱效（提高灵敏度）11. 改变有机添加剂 ，可增加柱效（提高灵敏度）12. 改变流动相配比方式 ，可增加柱效（提高灵敏度）样品 : 除草剂 流动相 : 52/48 0.1 M乙酸钠 /甲醇 , pH 6流速 : 0.45 mL/min 温度 : 40 , 90 检测 : UV 柱温的影响1. 西玛津2. 敌草隆3. 扑灭津4. 扑灭净5. 异丙甲草胺液相色谱柱 : Zorbax StableBond-C18色谱柱尺寸 : 4.6 x 150 mm, 5m4090 提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）液相色谱柱 : Zorbax StableBond-C8色谱柱尺寸 : 150 mm, 5m减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度流动相 : 60%乙腈 /40%水 流速 : 内径 0.3 mm-4 uL/min内径 0.5 mm-10 uL/min 内径 1.0 mm-50 uL/min 内径 4.6 mm-1.0 uL/min 温度 : 室温 检测器 : UV 254 nm样品 : 200