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输血前血型血清学检查 疑难标本的实验操作 及试剂的使用 北京市红十字血液中心 血液研究所 血型室 苗 天红 输血前血型血清学检查 （输血相容性检测） 临床输血技术规范要求 血型鉴定（受血者、献血者的ABO和RhD血 型） 抗体筛选（受血者意外抗体筛查） 交叉配血 一 ABO 血型 ABO 正反定型相符：正反定型相符且正定型反应强度4+ ； 反定型反应强度 2+。 ABO 正反定型不符的定义和范围 ABO 正反定型不符 （多或少抗原、抗体 ）。 ABO 正反定型相符 ，但弱反应，正定型反应强度 4+，反定型反应强度2+。 正定型为O型，反定型非O型或Ac、Bc凝集强度差 别 2+ 以上。 正反定型不符 ABO 正反定型不符 （多或少抗原、抗体） 正反定型不符 ABO 正反定型相 符， 但弱反应，正定 型反 应强度 4+， 反定型 反应强度 2+ 。 正反定型不符 正定型为O型，反定型非 O 型或Ac、 Bc凝集强度 差别 2+以上 正反定型不符处理的程序 排除仪器设备、试剂、标 本及操作失误。 查阅、询问病历资料，设 计针对性试验。 选择试管法做正反定型。 ABO血型鉴定 的特殊技术。 吸收放散试验 唾液型物质检测 毛细管离心分离自 身和输入红细胞 DTT处理自身凝集 红细胞 分子生物学检测 （血型基因） 询问、查阅病历 试管法正反定型 血型鉴定特殊技术 观察 假设 验证 解决 试管法 试管法：血型定型金标准，常用于疑难血型鉴定。 可以反复离心看结果。 可以延长抗原抗体反应时间， 可以改变反应温度 （4、 37孵育），有利于弱抗原、抗体的检出或排除冷凝集 素的干扰。 可以观察红细胞混合外观现象。 可以观察红细胞溶血现象。 试管法正反定型 ABO血型定型试 剂 抗-A 1 抗-A 1 用于检测A亚型。 注意： 抗-A 1反应阴性 A亚型 A型抗原减弱 A型新生儿与抗A 1反应阴性 或 弱反应 抗-H 抗-H 用于检测ABO亚型及 孟买、类孟买型。 ( A或B亚型H 抗原增强，孟买、 类孟买H抗原阴性。) 注意： 血液病致A、B抗原减弱，H抗 原 可能出现增强或减弱。 必须做对照试验。 抗-AB 抗-AB 用于鉴定A x和B x， 抗-AB 与A x、B x抗原会产 生 较强反应。 反定型 O细胞 用于确认反定型的 有效性,可以发现ABO 系 统 以外室温反应性抗体 干扰 ABO反定型。 自身对照 用于检测是否 存在自身冷抗体干扰 ABO反 定型 ，确认正反 定型的有 效性。 A2细胞 用于A亚型的鉴 定 （A亚型产生抗-A 1抗 体）。 注意： 反定型抗-A减弱，可能出 现与A 1细胞阳性反应，与 A2细胞反应阴性。 规范的摇试管方法 试管法凝集强度判读 反应强度 红细胞凝集情况 4+ 一个结实的大凝块，背景清楚 3+ 几个大凝块，背景清楚 2+ 中等大小凝块，背景清楚 1+ 小凝块，背景较混浊 w+ 有少量肉眼可见的凝集，背景红色混浊，显微镜下可观察到较多凝 集细胞 0 没有可见的细胞凝集，呈均匀的红细胞悬液 pH 部分溶血：残留部分红细胞，液体出现透明澄清红色 H 完全溶血：未见红细胞，液体出现透明澄清红色 mf 混合外观凝集，部分红细胞形成较大凝块，周围是游离的红细胞 试管法凝集强度 为什么要使用标准凝 集强度： 操作标准化。 实验结果有回溯性。 保证不同实验室、不同工 作人员对同一标本实验结 果的一致性。 吸收放散试验 表达弱 A和弱B抗原的红细胞直接离心试验中不被抗-A、 抗-B所凝集，但可以吸收相应的抗体。可以通过将其吸收 的抗体放散出来，并检测放散出来的抗体， 以证明弱A或 弱B抗原的存在。 吸收用RBC：盐水洗涤3次的待检压积RBC 1ml。 吸收用的抗血清：人源抗-A、抗-B 。 将压积RBC和抗血清按等体积比例混合， 在4孵育至少1 小时，期间 每 隔15 分钟混匀一次。 用冷盐水洗涤孵育后的细胞4-6次，得到压积RBC，加入等量盐水。 56水浴震荡10分钟，离心获得上清即为放散液。 用试剂红细胞检测放散液（人源抗体要做盐水介质和IAT）。 注意：一定要用O型红细胞做阴性对照。 巯基试剂消除自身凝集红细胞 巯基试剂：DTT、2-Me 巯基试剂可以裂解IgM抗体单体间的二硫键，用以消除冷 自身抗体造成的红细胞的自发凝集，为血型检测提供不凝 集的红细胞。 用盐水洗涤红细胞3 遍并配成50%的悬液，加入等量的 0.01M的DTT ，37孵育30分钟，将细胞洗涤3遍后配成 2-4%的悬液备用。 DTT处理自凝红细 胞 二 RhD血型 被检红细胞与抗-D试剂凝集者为RhD阳性，不凝 集 者为RhD阴性。 正常的RhD阳性：与IgM抗-D3+ 反应强度。 红细胞与IgM抗-D反应强度2+ D变异型 自身凝集红细胞 抗-D引起的新生儿溶血病。 血液病致D抗原减弱 直接抗人球蛋白强阳性红细胞 D抗原分类 D抗原的分类 ：根据D 抗原的数量和表位不同， 将D抗原分为以下3类： 正常的D：与IgM 抗- D3+ 反应强度。 D变异型 ：与IgM 抗-D 弱反应或阴性， 需IgG抗-DIAT才能 检出。 1.弱D（weak D） 2.部分D（partial） DEL型：只有吸收放散才能检出 D。 IgM抗-D试剂 对受血者只需用IgM抗-D试剂检 测 红细胞上是否有D抗原。 以输血为目的常规检测没有必要使 用高效价的单克隆抗-D试剂及 IgM+IgG单克隆抗-D试剂检测D 变 异 型及对D阴性的标本进行确认试 验， 否则有不必要的风险。因为： 1. 必须设立一个凝集强度来区分正常D 和 D 变异型，增大了误判的风险。 2. 用于献血者的抗-D试剂盐水介质离心 能 检出部分D 变异型。 3. 如果DAT阳性，用IgG抗-D做IAT试验 时 将D 阴性误判为D阳性。 切记：使用错误试剂的风险远远大于 报告一个D变异型。 IgM+IgG抗-D试剂 对初检为RhD阴性的献血者须 进 行RhD阴性确认试验，以确 认其 是RhD 阴性还是D 变异 型。 D变异型红细胞与大多数抗-D 试 剂在盐水介质中弱凝集或不 凝 集，但与抗-D试剂孵育或在 间 接抗人球蛋白试验中发生凝 集 。 抗-D试 剂 三 抗体筛选 抗体筛选的目的是确定患者血清中是否存在有临床意义的 抗体。 如果抗筛阳性，需要做抗体鉴定来确认有临床意义的抗体、 最终选择合适的血液输注，同时提醒临床医生可能推迟提 供配合的血液。 抗体筛选应该作为输血前检测的一部分， 它提供了比交 叉 配血更为可靠和灵敏的检测抗体的方法（剂量效应等）。 抗体筛选或鉴定比交叉配血更敏感， 认为：最严格的配血 能配上就安全的认识是不全面的。 抗体鉴定 患者抗体筛选阳性，如果时间允许，应做抗体鉴定并评估 其临床意义，抗体鉴定结果应记录在患者病历中。 1. 鉴定抗体类型：IgM、IgG。 2. 鉴定抗体种类：同种抗体、自身抗体 。 3. 鉴定抗体特异性: 抗-？ 输血科工作人员可根据抗体鉴定的结果判断配血的相合率 和选择最佳的交叉配血方法。 抗原检测的效率比盲配较高。 同种抗体 同种抗体的结果须永久保存 有剂量效应的抗体及一些弱抗体， 与相应抗原纯合子 反应、与杂合子不反应，配血相合不能保证输血安全 性。 随着时间的推移， 有些抗体会减弱甚至无法检出，配 血相合， 输血后会引起免疫记忆细胞在短时间产生大 量抗体，引起溶血性输血反应。 对于同种抗体， 每次输血都应选择无对应抗原的红细 胞成分， 而非仅配血相合。 抗体筛选的技术 患者血浆筛选细胞 患者血浆自身细胞（自身对照） 自身对照无须作为抗体筛检的一部分。 抗体筛选阳性，应做患者自身细胞对照， 这有助于识别高 频抗原的抗体还是自身抗体。 方法： LISS-IAT法（低离子强度盐溶液-间接抗人球蛋白试验 ）由于 它 的速度快、灵敏度和特异性高，被公认为检测有临床意义抗体的最 适合方法。 LISS-IAT法可以检测IgG抗体和37 有反应性的IgM抗体。 LISS-IAT法（试管法、 LISS/Coombs卡）。 筛选细胞 3% 0.8% 抗人球蛋白卡（LISS/Coombs 卡） 凝胶 玻璃珠 抗人球蛋白试剂 多特异抗-IgG+C3d 单特异抗-IgG 抗体筛选 抗体筛选：存在血浆干扰时应选择试管LISS-IAT法；存在自身抗体时选 择盐水介质-IAT法。 LISS-IAT：2滴血清（血浆）、1滴2-4% 的红细胞，加2-4 滴LISS 液后混匀，37 孵育15分钟 ，离心观察细胞的凝集、溶血情况，用生理盐水洗涤3遍后倾倒上 清液，控干， 加2滴抗人球蛋白试剂后混匀，1000g离心15s后判读结果。 盐水介质-IAT：2滴血清（血浆）、1滴2-4%的红细胞，37孵育45-60分钟，离 心 观察细胞的凝集、溶血情况，生理盐水洗涤3遍后倾倒上清液，控干，加2 滴 抗人球蛋白试剂后混匀，1000g离心 15s后判读结果。 可以将细胞配成0.8%的悬液，加50ul 到LISS/Coombs卡中， 直接离心判读结果。 特别注意：抗人球蛋白试剂 凝聚胺 试管中加入2滴血清（血浆）和1滴2%-4% 红细胞悬液， 混匀。 以1000g离心 15秒，观察结果 。如果阴性则继续试验；如果阳性，需 分析原因排除干扰后继续后续试验（此处发现并处理冷凝集素）。 加0.6-1mlLIM试剂，混匀后室温放置1 分钟。 加入2 滴Polybrene试剂，混匀后立即以1000g离心15秒， 弃去试管中 液体， 轻摇试管 ，肉眼判断红细胞凝集情况。如果有凝集出现则继续 操作， 如果没有凝集出现则该试验无效。 加入2 滴重悬液， 轻摇试管，肉眼观察结果。 结果判定：1 分钟内凝集消失为聚凝胺试验阴性，1分钟内凝集不消失 为聚凝胺试验阳性。 对于可疑的弱阳性结果， 可用生理盐水洗涤3 遍后， 加2 滴抗人球蛋白 试剂， 离心后判读结果。 四 交叉配血 抗体筛选阴性： LISS/Coombs卡、凝聚胺法。 如患者血浆中有（或既往曾有）临床可能有意义 的红细胞抗体，必须使用间接抗人球蛋白法进行 交叉配血。 1.同种抗体： LISS/Coombs卡（选择没有抗体对应抗原的红细胞成分）。 注意：IgM抗体，应加做试管盐水离心法。 2.自身抗体：经典-IAT 法。 3.同种抗体+自身抗体：经典-IAT法（选择没有抗体对应抗原的红细胞成 分）。 抗人球蛋白卡 VS凝聚胺 抗体筛选阴性 两种方法交叉配血结果不一致 按那种方法的结果发血？ 以抗人球蛋白卡为准吗？ 怎么办？ 找原因！找原因！找原因！ 抗人球蛋白卡 VS凝聚胺 凝聚胺法配血不合、 LISS/Coombs 卡配血相合 37度无反应性的IgM 抗体（同种抗体、冷自身抗体） 凝聚胺能检出而抗人球法漏检的抗体 LISS/Coombs卡配血不合、凝聚胺法配血相合 凝聚胺法会漏检抗