透明质酸酶的研究进展

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 透明质酸酶的研究进展 【摘 要】透明质酸酶是一类能 够降解透明质酸酶的酶的总称，广泛分 布于自然界，存在于哺乳动物、昆虫、 水蛭和细菌中。近年来，关于透明质酸 酶的研究逐渐增多，其在医学、整形等 领域的应用受到人们的重视。文章介绍 了透明质酸酶的研究进展，对于其分类、 来源、活性测定和应用进行了综述。 中国论文网 /1/view-12825961.htm 【关键词】透明质酸酶；分类； 来源；活性测定；应用 透明质酸酶（Hyaluronidases， 简称 HAase）是一种广泛分布、能够降 解透明质酸（HA）产生低分子化的酶 的总称1，大多数能够降解硫酸软骨素 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 （Chondroitin，CS） ，但速度较低。最 初发现透明质酸酶，是在 1928 年，发 现睾丸及其他组织中的提取物，通过促 进其他有害的毒液成分的渗透和增强它 们在血液中的行动不变性组织，发挥 “扩散因子”的作用。1940 年，Meyer 将 这种“扩散因子 ”正式命名为 Hyaluronidase。不同来源的 HAase 具有 一定的差异性，但从其被发现以来，逐 渐获得了人们的关注，已经被广泛应用 于医药等领域。也基于此，HAase 的性 质等相关研究成为了一个值得关注的领 域。 一、透明质酸酶酶的分类 根据透明质酸的作用机理，将 HAase 分为三种类型（ Meyer， 1971）： （a） 内酰胺- N -乙酰- D - 氨基葡糖 苷酶（EC 3.2.1.35）：该酶属于水解酶， 将高分子量底物（HA）作为主要末端 产物的通过内切的作用方式，作用于 - 1，四糖苷键进行水解，降解后得到的 终产物主要为饱和的四糖和六糖。来自 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 于膜翅目（Hymenoptera）毒液和哺乳 动物精子等动物来源的均属于此类。该 的酶也催化转糖基反应，在 HA 的水解 期间产生六糖和八糖。与后面两种透明 质酸酶不同的是，这一组不仅作用于 HA，还作用于硫酸软骨素。 （b） -葡 糖苷酸酶（EC 3.2.1.36）：来源于水蛭 和钩虫中，属于水解酶，通过内切作用 方式，作用于 -1，3 糖苷键，降解后 得到的终产物为四糖，且该酶为特异性 降解 HA。 （c ） 透明质酸裂解酶 （hyaluronate lyase，简称 HL） （EC 4.2.2.1）：多数是以细菌为代表的，还 包括真菌和病毒来源的一组酶，通过 - 消除机制的 N-乙酰己糖胺酶，通过作 用于 -1，4 糖苷键，在 C-4 和 C-5 之 间引入不饱和键。与前两种 HAase 不同， HL 的最终产物是二糖而不是四糖或六 糖。不同菌属来源的 HL，在底物特异 性上表现有所不同。 随着分子生物技术的发展，还可 以将 HAase 分为两大类，依据其蛋白同 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 源性，将其分为真核生物来源的 HAase 和原核生物来源的 HAase。 二、透明质酸酶的来源 透明质酸酶的来源广泛，分布于 各种脊椎动物（睾丸、动物毒液等）和 无脊椎动物（昆虫、水蛭，十二指肠虫 等）中，还存在于微生物中（链霉菌属， 葡萄球菌属、梭菌属等） 。 （一）真核生物来源的 HAase 在人类基因组中已经发现了六种 HAase-相似序列的基因编码，它们都显 示出高度的同源性。它们包括人类的 HYAL-1、HYAL-2、HYAL-3、HYAL- 4 和 PH20，以及在人类中转录但未翻译 的假基因 HYAL-Phyal1。前三个来源于 人的 HAase 基因（ HYAL-1、-2、-3） 聚集在染色体 3p21.3 位点，而后者的 3 个基因在染色体 7q31.3 位点上聚集。在 此基础上，HAases 被分为两部分。它 们大多数被认为是酸性的，因为它们的 活性在酸性条件下最高。相反，PH20 是中性活跃的 HAase，因为它在中性 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 pH 中活性最高的，商品化的重组人透 明质酸酶的氨基酸序列是 PH20，其在 医药领域应用广泛，是已发现的人类透 明质酸酶唯一一个最适宜体内的中性生 理环境同时保持高活性的酶2，3。 2015 年，美国 FDA 批准一种名为 Halozyme 的重组人类透明质酸酶注射 剂，作为其他注射药物的辅助药物，用 于皮下注射等促进药物扩散和吸收，但 是重组人透明质酸酶价格昂贵，无法实 现大规模应用，市面上目前只有国外能 够购买到该种酶，且由于其的免疫原性， 使之不能随意购买，因此想要使其能够 在我国医药领域广泛使用，现在的情况 不是很乐观。 目前市售的 HAase 中应用最为全 面的是来自于牛睾丸提取的透明质酸酶 （bovine testicular hyaluronidase， 简称 BTH） ，最初是 PrimaPharm 公司研制的 纯化牛睾丸透明质酸酶。BTH 为中性 HAase，主要将 HA 降解，终产物四糖 和饱和二糖，且其还可以降解其他种类 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 的糖胺聚糖硫酸软骨素。但提取后的该 酶纯度低，掺杂了许多杂蛋白，无法保 证酶的纯度，且其由于来源于动物，具 有较强的免疫原性，容易引起过敏反应。 来自水蛭和十二指肠虫等的 -葡 糖苷酸酶（EC 3.2.1.36）作用于 -1-3 糖苷键之间。这种类型的酶还有待进行 深入研究。其水解降解机制类似于脊椎 动物的 HAase。然而，在研究它们的催 化机理时，该类型的酶与脊椎动物的 HAase 降解模式的差异仍然存在。 （二）原核生物来源的 HAase 在 CAZy 数据库中，微生物来源 的透明|酸酶属于多糖裂解酶第 8、16 家族（PL8 、PL16 ） ，有些噬菌体也能 产生透明质酸酶，但是它的分子量远小 于细菌 HAase 的分子量，而且在胞外环 境下测得的活性很低。 多种细菌、噬菌体、真菌可表达 产生 HL，通常称其为消除酶或裂解酶 （EC 4.2.2.1） ，通过 消除机制引入不 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 饱和双键。很多细菌都可以产生 HL， 其中革兰氏阳性菌（Gram- positive，G+） ，经报道，大多属于致病 菌例如链球菌（Streptococcus） 、葡萄球 菌（Staphylococcus） 、4， 5等，这些 致病菌通过动物或人类的皮肤擦伤，逃 过其防卫机制引起感染。过程是其将自 身的 HL 分泌到胞外通过降解宿主体内 的透明质酸，使宿主体内的高分子 HA 参与免疫调节且具有抗炎活性，而微生 物产生的 HL 将高分子 HA 降解成寡聚 透明质酸，使其作为炎症反应的诱导因 子，在宿主体内建立适合该细菌自身的 生长环境，使宿主患滑膜炎、败血症等 的风险大大提高。而来自革兰氏阴性菌 （Gram-negative，G-）中的 HL，则属 于周质酶，为胞内酶，在发病机制中起 作用的可能性较小，其中一些 HL 也有 较低的软骨素裂解酶活性。细菌和真菌 来源的 HL，分子量一般较大，而细菌 来源的酶纯化工艺较简单，且来源更广， 成本较低，因此其市场应用价值更高。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 许多噬菌体产生的酶通常随噬菌体附于 细菌膜表面，膜中所富含的 HA 利于其 生长，通过初始的非渐进性的内溶活性 来消化 HA，然后以不饱和二糖作为最 终产物。 病毒来源的 HL 蛋白 序列与细菌来源的相似性极低，且分子 量远小于细菌和真菌来源的。研究发现， 有些不饱和透明质酸寡糖，例如由噬菌 体透明质酸酶 HylP6产生的不饱和透 明质酸寡糖，不仅不会促进乳腺癌细胞 的生长，还可以减少乳腺癌细胞的增殖、 转移和入侵，因此可能可以利用 HylP 独特的酶活性抑制透明质酸介导的肿瘤 生长和进展。来源于酿脓链球菌的透明 质酸裂解酶对降解 HA 后得到不饱和透 明质酸具有一定的抗氧化活性，而这些 功能是饱和透明质酸片段无法达到的， 因此微生物产生的 HL 对于降解产生不 饱和透明质酸寡糖的这些特殊的生物学 功能具有更广阔的应用前景。 三、透明质酸酶活性的测定方法 随着对透明质酸酶的深入研究， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 经文献报道，常见测定透明质酸酶活性 的方法很多，如 ELISA-like 法、平板法、 化学修饰法和毛细管电泳法等诸多方法。 但应用较多的是浊度法、3，5-二硝基 水杨酸法（3，5-dinitrsalicylic，DNS） 和 232nm 法等方法。 岫确 捍蠓肿恿康耐该髦仕嵫 卧谒峄血清中能够发生沉降现象，但 是经过降解的 HA 在相同条件下仍然澄 清。经过不断的研究，对浊度法不断修 正，发现马、兔和人血清、血清白蛋白、 牛血清白蛋白、十六烷基三甲基溴化氨 和西吡氯铵等均可以作为蛋白沉淀试剂 均可以用来测定酶活性，可使用马血清 作为沉淀剂。美国药典（采用马血清作 为沉淀剂，透明质酸酶是以 USP 标准 透明质酸酶（USP Hyaluronidase Reference Standard）为标准酶进行酶活 测定。中国药典（版）也是用血清作 为与反应的沉淀剂，以标准酶作为标准 品进行酶活测定。酶活定义：在特定温 度条件下，0.1mg HA 在 30min 内引起 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 的浊度降低 50%引起的浊度变化所需的 酶量定义为 1 个酶活力单位。 DNS 法：3，5-二硝基水杨酸法 （3，5-dinitrsalicylic，DNS 法） ，原理 是在碱性环境中 DNS 与透明质酸酶的 降解产物的还原性末端发生化学反应， 反应产物煮沸后呈现红棕色，颜色深浅 在一定范围内与还原糖含量呈线性关系， 还原糖含量越高，颜色差越明显， 585nm 下检测获得还原性糖的量来反映 酶活力。酶活力定义：以每 10min 产生 1nM 还原糖需要的酶量定义为一个酶活 力单位（U/mL） 。 232nm 法：糖胺聚糖裂解酶与糖 胺聚糖底物反应会产生不饱和双键，这 种不饱和双键在 232nm 处具有光吸收， 在一定范围内，吸光度值与不饱和双键 的含量呈线性关系，因此可以通过测定 OD232 下光吸收的数值来检测底物中不 饱和双键的数量，进而显示产物的生成 量来确定酶活力的大小。酶活力定义为： 每分钟催化产生 1 mol还原糖所需的 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 酶用量定义为一个酶活力单位（U） 。 四、透明质酸酶的应用 首先，可以应用透明质酸酶来制 备低分子透明质酸和透明质酸寡糖，从 而使低分子透明质酸（LMWHA）和透 明质酸寡糖（o-HA）可以发挥其生物学 功能，促进新生血管生成、促进创伤愈 合、抑制肿瘤等作用。有报道表明 HAase 降解产生的 o-HA 可以促进预产 大鼠子宫颈收缩，从而缩短生产过程， HAase 还有助于恢复大鼠损伤的脊髓的 功能。 其次，由于最初作为“扩散因子” 被发现，因此，透明质酸酶可以与其它 药物共同作用进行给药，促进药物的扩 散和吸收。当用作为单次短期作用剂量， 暂时地去除可被用来增强将溶液和药物 吸收入组织，使其组织液的黏度降低， 从而增加膜的通透性将药物传送入间质 空间。HAase 对于麻醉剂的扩散是有效 的，有助于治疗性流体、分子和蛋白质 的治疗性的物质的扩散给药。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 HAase 可以用于眼科手术帮助麻 醉，青光眼、白内障手术中有效控制眼 压，视网膜玻璃体手术中降低 HA 的粘 滞性有效降低手术危险。整形美容领域， 透明质酸酶用于除皱或者面部注射透明 质酸除皱后不良反应的后处理等。通过 将人的 HAase 基因 PH20 与溶瘤腺病毒 （oncolytic adenovirus， OAV）整合， 使 HAase 发挥作用，降解 HA，促进 OAV 在肿瘤细胞中的扩散，使肿瘤减 小，提高疗效7。人重组 HAase- rhPH20 还可以用于糖尿病治疗中，可 加速胰岛素的扩散，更快达到最高作用， 有效控制了糖尿病人的血糖浓度。同时， HAase 具有很强的生血作用，增强血管 的通透性，从而使药物更容易暴露，由 于 HAase 的各种作用，已经广泛应用于 临床中。 五、总结 透明质酸酶是一种广泛分布和被 忽视的酶，具有不同的底物特异性，广 泛的 pH 值，不同的催化机制和各种各 -精选财经经济类资料- -最