atp结合盒转运蛋白与mdr逆转剂

ATP 结合盒转运蛋白与 MDR 逆转剂 发表者：姜超 248 人已访问 目前恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生命，是人类死亡的主要病因之一，其发病率逐年上升。 肿瘤的治疗临床上是以手术或者放化疗为主，结合生物免疫以及中医药治疗为辅的综合治疗。 其中化疗是绝大多数肿瘤病人都需要使用的重要治疗措施。少数肿瘤可以通过化疗达到临床 治愈，然而对于大多数肿瘤化疗药物无法根本上铲除肿瘤。化疗失败的主要原因之一就是肿 瘤耐药。肿瘤耐药可以分为原发耐药和获得性耐药，分别指肿瘤细胞在未接触化疗药时就已 经具有的耐药性和在化疗过程中逐步产生的耐药性。肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性 的同时，对结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物往往也产生交叉耐药，这种现象被成为肿 瘤的多药耐药(multidrug resistance，MDR)，是放化疗失败和肿瘤复发的关键原因。 ATP 结合盒（ATP-binding cassette,ABC）转运蛋白家族介导的药物外排泵机制是肿瘤耐药 的重要发生机制 1。根据序列同源性与结构域组成，ABC 家族基因可分为 ABCABCG 等个 7 亚 家族 2，分别编码不同跨膜蛋白。它们的共同特点是在跨膜区组成通道, 胞浆内面存在 ATP 结合区，在 Mg2+ 的参与下水解 ATP，完成磷酸化，调节跨膜蛋白离子通道活性 3，因而能够 转运多种疏水性分子。当这些结构不同的底物进入细胞的浆膜后，ATP 转运蛋白可以识别并 与之结合，引起 ATP 结合区的活化，从而水解 ATP，跨膜通道的构象发生改变，将底物泵出 到细胞外。随后，再次发生 ATP 分子水解，使转运蛋白恢复到原来的构象。这样转运蛋白则 以 ATP 能量依赖的方式主动地将疏水性的底物从细胞内泵出到细胞外。如果将进入细胞的抗 肿瘤药再重新泵出到细胞外，就会降低细胞内药物蓄积, 从而起到降低抗肿瘤药疗效产生耐 药作用。研究表明，ABC 转运蛋白不仅在肿瘤细胞中高表达, 在许多正常组织细胞中也高表 达, 具有一定的生理功能。脑、肝脏、小肠、大肠、胰腺、肾脏、睾丸及肾上腺等的上皮 细胞及某些内皮细胞均被发现有 ABC 转运蛋白的表达 4。ABC 转运蛋白具有以下生理功能： 将外源性毒素分泌到胆管、肠管、泌尿系统内, 促进排泄，减少吸收；跨膜转运甾体类激素 有利于发挥其正常作用；维持血脑、血胎盘及血睾屏障功能，防止大脑、睾丸、胎儿受到不 良影响；保护和调节干细胞的功能；维持某些口服类药物如地高辛等的生物利用度（这些药 物往往是 ABC 药泵的底物） 5。，ATP 转运蛋白家族中 P-糖蛋白( P-glycoprotein, P-gp,) 、多药耐药相关蛋白( multidrug resistance-associated protein, MRP) 以及乳腺癌耐药 蛋白( breast cancerresistance protein, BCRP)与 MDR 的关系最为密切，也是 MDR 逆转研 究的热点。 1 P-gp 人类 P-gp 是 1 个磷酸化和糖基化的跨膜外向转运蛋白，由 ABCB1(MDRI)基因编码, 位于人类 染色体 7q21.1, 由 1280 个氨基酸组成, 分子量为 170000, 包含 2 个同源单体,每个单体又含 有 6 个疏水跨膜部分和 1 个胞内 ATP 结合部位组成和高度保守的“Walker A”和“Walker B”结构。多种化疗药物包括蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼乙叉甙类及米托蒽醌、丝裂 霉素等都是它的底物。肿瘤细胞上高表达的 P-gp 可以降低抗肿瘤药物在细胞内的累积，从而 导致临床耐药的发生。 研究证实几乎所有类型的肿瘤，包括肉瘤、白血病、淋巴瘤等在内，均有 MDR1 基因的表达。 根据 MDR1 基因在人体肿瘤中表达的水平，Nooter 6将肿瘤分为三类：（1）MDR1 基因高度表 达的肿瘤，如肾癌、胰腺癌、肝细胞癌等。这类肿瘤的来源组织本身就有中等或高度的 MDR1 基因的表达，多表现为原发性耐药，化疗效果差；（2）MDR1 基因中度表达的肿瘤，如乳腺 癌、神经母细胞瘤、白血病等。这类肿瘤较敏感，但是大部分病人在化疗结束后都有复发， 复发后 MDR1 基因表达的水平更高，对原来敏感的化疗药物耐药；（3）MDR1 基因低度表达的 肿瘤，如卵巢癌、小细胞肺癌等。虽然这类肿瘤对化疗药物敏感，但是也会产生多药耐药。 Burger 等 7用实时定量 RT-PCR 方法分析了 59 例原发乳腺癌标本，结果表明 P-gp 的表达水 平与化疗药物的初次治疗效果呈负相关，而且 P-gp 高表达的肿瘤往往预后较差。 P-gp 已经成为一个重要的肿瘤靶点，通过抑制 P-gp 功能或表达从而逆转肿瘤细胞的多药耐 药性，使肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性具有非常重要的临床研究和应用价值。P-gp 抑制 剂（MDR 逆转剂、肿瘤化疗增敏剂） 8近来成为研究的热点，根据 P-gp 抑制剂出现的先后顺 序和作用特点将其分为三代： 第一代抑制剂的研究开始于 1981 年。有学者发现钙离子通道阻滞剂维拉帕米能够通过直接与 部分抗肿瘤药物竞争 P-gp 药泵的外排作用，而提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度，从而达到逆 转 MDR 的作用。后来发现其他的钙通道阻滞剂也有类似作用。第一代 P-gp 抑制剂还包括：钙 调蛋白拮抗剂，环孢菌素，喹啉及甾体激素类等，其中环抱素的作用最强。它们的主要特点 是在体外试验中可以逆转甚至完全逆转 MDR。但在体内试验中，由于自身的剂量限制性毒性， 体内不能达到有效逆转 MDR 所需要的浓度，例如体内运用维拉帕米出现的严重心血管副作用 和环孢菌素强烈的免疫抑制毒性等。第 1 代逆转剂在未达到抑制转运蛋白的低浓度就会出现 严重的人体副作用, 从而失去临床应用价值。 第二代抑制剂是通过改造第一代抑制剂的结构，筛选出逆转活性高而自身毒副作用低的化合 物，代表化合物有 PSC833 和 VX-710（环抱素 D 的类似物）还有 dexverapamil、dexniguldipine 等。由于很多化疗药物既是 P - gp 的底物，也是细胞色素 P450 的同工酶 3A4 的底物，增敏剂对 P450 3A4 的竞争结合影响化疗药物的代谢，导致化疗 药物血药浓度升高，产生毒副作用。例如 PSC833 比环抱素逆转的作用强 1020 倍，且在动物 模型中与抗肿瘤药物联合应用时，可使肿瘤体积明显缩小，并有效延长荷瘤动物的寿命 9。 但在临床试验中发现，PSC833 能够通过抑制细胞色素氧化酶 P450-3A4 介导的紫杉醇和长春 新碱代谢，使患者血浆内细胞毒药物水平明显升高而产生毒副作用 10。VX-710 是一种能够同 时抑制 P-gp 和 MRP 活性的逆转剂 11，逆转活性很高，约为第一代抑制剂的 100 倍以上。然 而, VX-710 在与紫杉醇联合用药时能显著降低肿瘤患者的紫杉醇清除率导致毒副反应出现。 第三代 P-gp 抑制剂药物的特点是克服了第二代的缺陷，在与抗肿瘤药物合用时，不影响它们 的药代动力学。主要包括：GF120918、LY335979、Lanquidar（R101933）、 ONT2093（OC1442093）以及 XR9576 等。目前已进人临床试验的代表性化合物有 LY335979 和 XR9576 等。属于一种二苯基幽烷类衍生物，是一种 P-gp 高度特异性的抑制剂，但其并非 P- gp 的底物，对 MRP 及 BCRP 无影响，也是迄今发现的最强的 P-gp 逆转剂之一，XR9576 是邻氨 苯甲酸的新型衍生物，是一种逆转作用极强、P-gp 高度选择性的抑制剂。体内实验表明, XR9576 能够显著增强阿霉素、长春新碱及紫杉醇等对人体 MDR 肿瘤模型的治疗作用，而且不 影响这些药物的药物代谢。期临床试验也证实其对部分多药耐药肿瘤有良好的逆转作用 12。 试验表明 LY335979 能够明显减小荷瘤小鼠的肿瘤体积，并提高实验动物的生存率，更为重要 的是 LY335979 不影响细胞毒药物的代谢动力学，具有一定开发应用前景 13。 2 MRP MRP 亚家族主要有 9 个成员:MRP1MRP7、ABCC11 和 ABCC12，基本结构与 P-gp 类似，其中一 个由 5 个 螺旋组成的 N 末端区域，而 MRP4、MRP5 则没有此结构。所有的 MRP 糖基化位点 在第 2 部分的第 1 个跨膜域外部及末端的延长结构上。Colo 等 1992 年从小细胞肺癌 H69 /AR 耐药细胞系中克隆出耐药相关基因 MRP 属于 MRPC 家族。与 P- gp 不同，MRP 主要转运疏水性 不带电荷的分子或水溶性的阴离子化合物。许多已经证实能够逆转 P - gp 介导的药物对由 MRP 介导的 MDR 无效。在肝癌细胞中研究发现 14，MRP1 表达水平和肿瘤的分化、类型以及微 血管侵入相关,MRP1 显著上调则肝癌预后明显较差。在对 162 名手术切除肝癌患者的研究后， 有学者发现 MRP1-1666GG 基因型高表达与肝癌患者低存活率相关 15。VOREM 等 16转染肝癌 细胞株 HepG2 反义 cMOAT cDNA 使 MRP2 基因的转录被抑制， 发现转染人细胞的 NA 的浓度 高低与 MRP2 活性成反比，而相应的一些化疗药物的半数抑制浓度在 cMOAT cDNA 组也降证 明对 MRP2 基因的转录抑制后，可增强肝癌细胞的化疗敏感性，并逆转其多药耐药；目前， 研究发现主要有以下药物可能逆转由 MRP 介导的 MDR，包括维拉帕米及其衍生物、环孢素 A、 黄酮类、抗激素类、喹啉类。GST 酶抑制药、非甾体抗炎药如阿司匹林、吲哚美辛、异唑; 唑啉衍生物、地高辛等。维拉帕米可以通过竞争性的与膜上的耐药蛋白（P- gp、MRP1） 结 合，达到逆转 MRP 多药耐药，通过抑制耐药基因（P- gp、MRP1） 的表达增加化疗药物的敏 感性 17；Connor 等在研究过度表达 MRP1 的 NC IH460 细胞时，又发现苏灵大( su-lindac)具 有逆转 MRP1 介导的对 ADR 的耐药 18 。以上药物能够进入细胞内抑制 MRP，但是这些抑制剂 与 MRP 亲和力低且缺乏特异性，可能是因为 MRP 主要转运阴离子化合物,而阴离子化合物如 PAK -104P、非甾体抗炎药物和 ONO1078 等很少进入细胞内,所以抑制剂在细胞内很难达到有 效抑制浓度。 3 BCRP BCRP 是最近发现的一个 ABC 药物外排转运蛋白，其为分子量为 95000 的磷酸化蛋白，与其他 的 ABC 转运蛋白相比较，在结构上属于半转运蛋白，仅有 6 个 螺旋和 1 个 ATP 结合位点， 多在细胞膜上以同源二聚体的形式发挥作用。目前认为 BCRP 定位于细胞膜, 这表明它可能 主要参与膜内、膜外药物转运, 而不是改变药物在胞内的分布。BCRP 在正常组织中的分布较 广泛, 主要分布于具有分布、排泄功能的组织, 尤其在胎盘组织中含量特别丰富。 Fumitremorgin C( FTC)和 GF120918 是最早发现的 BCRP 增敏剂，Rabindran 19等发现了 FTC 可降低肿瘤细胞耐药性，增加细胞内的药物聚集，可以有效逆转米托蒽醌，阿霉素， topotecan 耐药。而且对 P -gp 或 MRP1 介导的耐药性影响小，已经成为 BCRP 的药理学研究 的有用工具，但因为神经毒性不能用于动物和人体。目前已经合成多种毒性低、活性强的 FTC 类似物如 Ko143，有望成为临床运用 20 。Yasuo Imai 等认为，植物性雌激素( phytoestro2gens)可以逆转 BCBP 介导的 MDR，研究中发现，植物性雌激素/黄酮类化合物可 增强 SN - 38 和米托蒽醌对 BCRP 转导的 K562 细胞的细胞毒性。糖基化的黄酮类化合物对 P - gp 介导的长春新碱抗药性和 MRP1 介导的 VP - 16 的抗药性均无影响，然而二者可以增加 拓扑替康在 K562 /BCRP 细胞的积聚 21 。研究者认为，黄酮类化合物和糖基化黄酮类化合物 可能会成为克服由 BCRP 介导的肿瘤细胞多药耐药的有效药物，如果将黄酮类化合物与 BCRP 底物的抗肿瘤药物联用，可能会改变药物动力学,从而提高特异抗肿瘤药物对肿瘤细胞的细胞 毒性。Ahmed - Belkacem 等 22 在研究中发现， 6 - Prenylchrysin 和 Tectochrysin 是 BCRP 的特异抑制剂。与 GF120918 相比,这两种化合物对 P- gp 和 MRP 均无影响，表现出更低 的细胞内毒性，且不改变 ATP 酶活性。Nakamura 等 23 发现 Gefitinib 可以直接逆转 BCRP 介导的 MDR。研究中,发现 10mol Gefitinib 可以逆转肿瘤细胞对拓朴替康、SN - 38 和米 托蒽醌的抗药性，提高拓朴替康在耐药细胞内的蓄积。Gefitinib 直接抑制拓朴替康转运到 囊泡。双嘧哒莫 24 被发现是一种新的 BCRP 的底物，同时一些钙离子阻滞剂如尼卡地平、尼 群地平和尼莫地平可有效抑制米托蒽醌在 BCRP 过度表达的 HEK ( human embryo kidney,人 胚胎肾)细胞的外排现象，而同为钙离子阻滞剂的地尔硫艹卓和维拉帕米无此效果。 近年来中药逆转肿瘤耐药的研究也得到了广泛的开展。对于中药的活性成分对药物代谢酶和 转运体影响的研究很多，并且发现其中一些植物多酚、黄酮、萜类等对 P-gp 都有一定的抑制 作用 25-27。有研究证实五味子醇甲 A 能够增强 VCR 对耐药肝癌细胞 HepG2/ADR 的细胞毒作 用，其机制是通过影响 P-gp 底物复合物的形成及功能而实现逆转 P-gp 介导的多药耐药 28 。 白花蛇舌草提取物对多药耐药白血病细胞 HL260/ADR 的生长也具有极强的抑制作用，诱导 MDR 其凋亡是其主要机制 29 。在 K562/ADM 裸鼠移植瘤多药耐药模型中，张姚庆华等 30 发现复方藤梨根制剂可以增加肿瘤细胞内 ADM 蓄积浓度，实现部分逆转移植瘤的多药耐药性， 其机制之一是通过抑制 P-gp 增加的而实现的。中药复方的研究也在同时进行，有研究发现由 黄芪、白术、北沙参等组成的益气养阴方能显著提高顺铂对耐药细胞株 A549/DDP 的增殖抑 制作用，具有协同增效的作用，逆转 A549/DDP 细胞的凋亡抵抗可能是其逆转 MDR 的作用机 制之一 31 。中药在逆转肿瘤耐药的同时，往往还具有抗肿瘤、调节免疫等功能，有利于提 高肿瘤的整体治疗水平，这是一个颇具临床应用前景的新的研究领域。为临床抗肿瘤药物的 研发以及抗肿瘤治疗新方法的发现带来了新的希望。 从 G418筛 选 ， 转 染 到 单 克 隆 化 的 总 结 筛 选 之 前 确 定 G418 浓 度 ： 1.由 于 每 种 细 胞 对 G418 的 敏 感 性 不 同 ， 而 且 不 同 的 厂 家 生 产 的 G418有 效 成 分 的 比 重 不 同 ， 一 般 1g 的 粉 剂 中 有 效 的 G418含 量 大 约 为 0.722g。2.G418 是 新 霉 素 的 类 似 物 ， 两 者 都 是 通 过 抑 制 核 糖 体 的 功 能 和 蛋 白 质 的 合 成 而 杀 死 细 胞 的 。 但 是 新 霉 素 对 真 核 细 胞 无 作 用 而 G418 对 细 菌 和 真 核 细 胞 都 起 作 用 。 neo就 是 编 码 3磷 酸 转 移 酶 的 基 因 ， 它 表 达 的 蛋 白 能 够 分 解 新 霉 素 和 G418。 在 进 行 转 染 时 细 胞 膜 受 影 响 ， 抗 生 素 可 能 对 细 胞 产 生 较 大 影 响 ， 加 上 G418 有 杀 菌 作 用 ， 所 以 有 人 主 张 转 转 染 时 不 加 其 它 抗 生 素 。 3.汇 合 度 对 G418 筛 选 结 果 的 影 响 很 大 ， 一 般 筛 选 时 汇 合 度 不 宜 超 过 50% 4.G418 的 活 性 不 尽 相 同 ， 所 以 在 筛 选 之 前 ， 一 定 要 确 定 G418 的 最 佳 筛 选 浓 度 。 具 体 如 下 ： 将 细 胞 稀 释 到 1000 个 细 胞 /ml， 在 100ug/ml1mg/ml 的 G418浓 度 范 围 内 进 行 筛 选 ， 选 择 出 在 1014 天 内 使 细 胞 全 部 死 亡 的 最 低 G418浓 度 来 进 行 下 一 步 的 筛 选 试 验 。 一 个 具 体 试 验 ： 3*106 个 细 胞 电 转 后 ， 分 别 接 种 1/4000，1/1000，1 /300细 胞 到 孔 板 中 ， 48h 后 加 药 筛 选 ， 此 时 1/300 细 胞 孔 内 大 约 50%汇 合 度 。 理 论 上 1/4000 孔 内 应 有 4%的 汇 合 度 。 筛 选 9 天 后 ， 观 察 1/4000 孔 内 有 两 三 个 克 隆 ， 按 比 例 1/300孔 内 应 该 有 几 十 个 克 隆 ， 事 实 上 ， 它 们 几 乎 全 死 光 了 ， 只 有 几 个 克 隆 加 药 时 间 和 维 持 浓 度 1.由 于 基 因 转 染 到 细 胞 内 之 后 要 一 段 时 间 才 能 表 达 出 蛋 白 质 。 所 以 筛 选 不 能 太 早 ； 但 是 也 不 能 太 晚 ， 因 为 转 染 了 外 源 基 因 的 细 胞 代 谢 负 荷 较 大 ， 增 值 较 慢 ， 时 间 长 了 就 会 被 没 有 外 源 基 因 转 入 的 细 胞 所 淹 没 ， 最 终 导 致 筛 选 不 出 阳 性 克 隆 ， 一 般 要 在 转 染 24 小 时 之 后 才 开 始 加 G418 筛 选 。 随 着 细 胞 的 代 谢 G418 的 浓 度 和 活 性 都 回 下 降 ， 所 以 每35天 都 要 更 换 一 次 含 有 G418 的 筛 选 液 。 这 时 药 物 浓 度 可 以 降 至 200ug/ml。 2.加 抗 生 素 的 时 机 ， 主 要 是 考 虑 插 入 到 细 胞 基 因 组 的 抗 性 基 因 是 否 已 经 得 到 表 达 。 一 般 是 转 染 48 小 时 后 加 入 抗 生 素 。 挑 出 单 克 隆 后 就 可 以 用 维 持 浓 度 ， 一 般 是 筛 选 浓 度 1/2。关 于 维 持 浓 度 ， 有 人 说 细 胞 会 出 现 对 抗 生 素 的 抗 性 ， 应 不 断 提 高 其 浓 度 。 而 且 ， 如 果 你 要 挑 选 到 几 个 阳 性 克 隆 中 较 高 表 达 的 克 隆 的 话 ， 可以调整抗生素的浓度。当 然 ， 抗 性 基 因 高 表 达 ， 目 的 基 因 不 一 定 就 跟 着 高 表 达 。 筛 选 时 的 培 养 液 加 药 筛