p53基因与癌症和衰老相关性的概述

P53 基因与癌症和衰老相关性的概述 摘要：p53 基因抑制肿瘤是众所周知的，但可能也影响与肿瘤抑制 无关的衰老过程。p53 对各种应激做出反应，诱导细胞凋亡或阻滞 细胞周期，以抑制肿瘤的发展。然而，在非癌衰老过程中 p53 的作 用是复杂的。一方面，p53 基因能诱导细胞衰老或凋亡来抑制癌症， 但其后果就是加快了衰老。另一面，P53 可以减缓生长和减少与生 长有关的应激使细胞存活，最终延缓衰老。要想阐明其在衰老过程 中的作用，并针对 P53 或 P53 转录靶点来治疗癌症和改善衰老，就 必须更好地了解 p53 功能的多样化。 关键词：DNA 损伤，细胞生长；细胞衰老；细胞凋亡，无氧酵解 引言：p53 基因是一种转录因子，其在哺乳动物中抑制肿瘤的发生 已经得到了广泛研究（13 ） ，但越来越多的证据表明， p53 基因也 影响衰老过程。但是，p53 究竟是怎样影响衰老的还不是很清楚。 p53 调控大量有致癌作用的基因的转录，包括细胞周期阻滞 （P21，GADD45，14-3-3s，RPRM） ，细胞凋亡 （Scotin，killer，FAS ， BBC3，PERP ，53BP1，BAX，LRDD ，PMAIP1） ， 抑制有氧糖酵解（GLUT1，TIGAR，己糖激酶，磷酸甘油酸变位酶） ， 促进氧化磷酸化（OXPHOS） （SCO2，AIF） ，细胞生长（PTEN，AMPK 测试，TSC2，IGF-BP3） （4 ） ，以及蛋白质的翻译（sestrins） （5 ） 。 P53 还具有与转录无关的其他作用，包括调节微 RNA 加工（6） ， DNA 修复（7） ，线粒体蛋白存活（8）和核糖体合成（9,10） 。因此， p53 是维持基因组完整性，调节细胞生长和细胞增殖的关键，是抑 制肿瘤的核心（11） 。同时， p53 通过一个非癌症相关的机制影响寿 命，这个机制来源于线虫 p53 基因（CEP-1）的敲除实验，延长了寿 命（12） 。此外，人类流行病学研究显示，p53 蛋白密码子 72（精氨 酸-脯氨酸）中氨基酸变化产生的多态性减少潜在的细胞凋亡（13 ） ， 并导致癌症风险增加。但是，这恰恰增加了对 p53 介导的细胞凋亡 预防癌症并且影响衰老这一观点的支持（13-15） 。所以，设计和实 验能够增强肿瘤 p53 的功能的相关治疗方法，对改善或延缓衰老可 能是有用的。 1、 p53 和细胞衰老的关系 改变了 p53 活性的小鼠模型论证了，除了在肿瘤抑制方面，p53 基 因还影响衰老和寿命。这些模型包括 p53 基因中简单无效突变的同 源或杂交小鼠到能够破坏 p53 的某些生化功能的点突变的小鼠。综 述了在生物体中 p53 基因功能的复杂性。 1.1 相比于 p53 基因的缺失， BAC 中 p53 基因的过度表达能够降 低癌症水平而不影响衰老（16） 。此外，Arf 和 p53 的过度表达进一 步降低癌症水平，延长寿命（17） 。类似地，减少 MDM2（负调节 p53 基因） ，提高 p53 水平降低癌症的发病率而不影响衰老（18） 。 因此，增加野生型 p53 的水平显然能降低癌症的发病率，而不影响 衰老。从理论上讲，单纯提高 p53 水平并不会导致正常细胞中 p53 活性的增强。只有当那些控制 p53 活性的蛋白超出正常水平时提高 p53 水平才是有害的。 1.2 p53 基因的多种亚型及 p53 相关的家族成员（p63 和 p73） 是由使用不同启动子、选择性剪接和翻译起始位点产生的（19,20） 。 它们影响癌症的方式可能不同，其差异并不清楚（21） 。除了具有独 特的功能，p53 的亚型还可与全长的 p53 相互作用并调节其活性。 亚型比例的差异可能会影响发育，细胞增殖，应激反应，以及癌症 和衰老。因此，不同亚型的 p53 可能对肿瘤的形成有独特的活性。 1.3 N-末端截断的 p53 基因亚型能够加速衰老，过表达可以降 低癌症（23,24） 。另外，N-末端截断的 p53 亚型的过度表达降低了 组织的功能和再生，这表明干细胞和祖细胞有缺陷（26） 。为了支持 这一观点，在老年小鼠中，一个 p53 基因副本的缺失增加了增殖造 血干细胞和祖细胞的数量，而 N-末端截断的 p53 基因表达活性增加 的小鼠并没有显示出这种增加（27） 。为了在表达截断的 p53 基因的 小鼠中实现早衰表型，还需要全长的野生型 p53，这表明截断亚型 与全长 p53 基因四聚体相关。N-末端截断的 p53 亚型中的一个被发 现与全长 p53 基因相互作用，即使没有应激的情况下也能增加稳定 性和核定位（28） ，在 Mdm2 的存在下另一种亚型稳固 p53（29 ） 。 因此，一个特定的 p53 亚型的过表达可能影响其它亚型和整体 p53 的功能。 1.4 有一半的人类癌症中发现了 p53 的基因突变，还有一些则 发现了 p53 通路的其它部分被改变。这些突变使肿瘤细胞能够逃避 细胞周期检查，避免细胞凋亡，衰老，并且能够在低于正常细胞扩 散的条件下扩散。大多数肿瘤相关的 p53 基因突变是在 DNA 结合结 构域内。不同程度的影响了 p53 结合靶基因的能力，因此可能会改 变整个蛋白构象。 1.5 很难识别影响衰老的相似基因突变，因为他们不会以相同的 方式被选择。然而，最近在人群中发现的多态性表明，p53 蛋白的 微小变化也可以影响长寿和衰老。密码子 72 中的脯氨酸简单替换为 精氨酸阻碍了 p53 基因诱导细胞凋亡的能力，并导致增加癌症的风 险。但是，这种多态性集中在老年人口并与长寿相关。我们预测， 会发现更多这样的影响衰老过程而与癌症无关的基因突变和多态性。 2、 p53 活性与癌症的调节机制 2.1 p53 基因受到多种机制的严格调控，调控其活性，稳定性和 定位。因此，增强的 p53 调控可以导致癌症。针对 p53 的相关调控， 能有效地激活癌症中的 p53 基因。MDM2 （鼠双微体 2）和 MDM4（a.k.a.MDMX ）调节 p53，它们的过表达能有效的抑制 p53 的功能，提高了患癌症的风险。MDM2 蛋白是一种导致 p53 降解的 泛素连接酶。当 MDM2 蛋白处于高水平， P53 能够多聚泛素化并通 过蛋白酶体靶向降解。MDM2 也能够直接抑制 p53 活性。当 p53 基 因被激活时，MDM2 的水平升高，然后降低 P53，这就建立了一个 负反馈通路。MDM4 不是 p53 的泛素连接酶，但通过与 MDM2 形 成杂络物增强 p53 的泛素化。MDM2 和 MDM4 的异二聚体在胚胎发 育过程中（但不是在成年小鼠）调节 p53 是很重要的（30） 。细胞凋 亡和细胞周期阻滞引起的 MDM2 和 MDM4 突变能够导致胚胎死亡。 此外，似乎 MDM2 调节 p53 的稳定性，而 MDM4 调节 p53 的活性 （31） 。在 P53 调节中 MDM2 和 MDM4 还有组织特异性（32 ） 。因 此，MDM2 和 MDM4 相互且独立地调节 p53。 2.2 至少有一半的肿瘤是由 p53 突变引起的，而许多与野生型 p53 有关的肿瘤因为 MDM2 的过表达明显使 p53 功能性失调。因此， 与 MDM2/p53 结合的小分子可以有效地恢复 p53 活性而不会造成基 因毒性应激。这一方法对于那些含有野生型 p53 的小儿癌症特别有 效（33 ） 。MDM2 和 MDM4 有一个互补模式，所以 MDM4 也是一个 增强 p53 功能的潜在靶目标（34 ） 。重要的是，在缺失 MDM4 的情 况下,p53 功能的恢复提高了肿瘤小鼠的寿命（35 ）,并且 p53 的暂时 性恢复不是致命的。到目前为止，还没发现能够扰乱 MDM4 和 P53 相互作用的化合物。因此，全身性的 MDM4 抑制是恢复肿瘤中 p53 功能的一种方法，并有可能比 MDM2 的抑制的毒性更小。 2.3 除了小分子 Nutlin，有几种化合物似乎能够通过改变其构象 来激活 p53（36） 。在包含一些 p53 突变的肿瘤细胞中，小分子 CP- 31398 通过阻断泛素化能恢复 p53 的活性，而不干扰 MDM2 蛋白的 相互作用。CP-31398 也有可能激活 p53 家族成员 p73 和 p63，促进 抗肿瘤作用。最近，化学药品 PRIMA-1（p53 激活并诱导大量细胞凋 亡）已证明在表达突变型 p53 的肿瘤细胞中介导 p53 依赖的细胞凋 亡是很有前景的（37） 。PRIMA-1 的衍生物 APR-246 能够激活未折叠 的野生型 p53 及突变型 p53 基因;表明它可能在有或没有 p53 基因突 变的肿瘤中起作用。在任何情况下，激活 p53 的肿瘤抑制效应似乎 是一种很有前景的治疗策略，未来可能会降低高毒性化疗药物的使 用（38） 。 3、 P53 基因的转录后修饰与细胞衰老 除了泛素化，p53 翻译后修饰还包括磷酸化，乙酰化，类泛素化修 饰，SUMO 蛋白质修饰和甲基化，所有这些都是调节 p53 活性所必 需的。p53 蛋白是一种抑制细胞增殖或者诱导细胞凋亡或衰老的高 度调节蛋白，对各种细胞应激做出应答，包括 DNA 损伤，氧化应激， 缺氧，和致癌信号。在没有应激的正常细胞中，p53 蛋白的水平和 活性都非常低。当细胞受到刺激，p53 蛋白的水平增加，p53 的转录 活性被激活。p53 活性有可能阶段性的进行调节，p53 的不同活性， 无疑是通过不同的修饰进行不同的调节。这些修饰很大地影响着 p53 的肿瘤抑制活性，并有可能影响到 p53 对衰老的作用。 3.1 p53 蛋白具有多个丝氨酸/苏氨酸残基作为许多蛋白激酶的 磷酸化位点。这些位点的磷酸化状态随着应激信号而改变。许多重 要的调控位点都集中在 N-末端的激活结构域，有一些也存在于 C 端 调节结构域。有些位点可以通过多种激酶磷酸化而有些激酶可磷酸 化多个位点。其中有两个重要的位点是丝氨酸 15（在小鼠 p53 蛋白 中是丝氨酸 18）和丝氨酸 20（在小鼠中是丝氨酸 23） 。这些位点通 过 ATM 和其他激酶磷酸化对 DNA 损伤反应做出应答。当这些丝氨 酸都被磷酸化时，与负调控 MDM2 的相互作用就会被削弱，稳定 p53 并允许其与辅（共）激活因子相互作用，激活转录。这些位点 中丝氨酸和丙氨酸突变的突变小鼠（不能磷酸化）中增加了 p53 的 稳定性和转录。然而，表现型有组织特异性，并且没有组织培养实 验预测的那么严重，这表明磷酸化不是控制 p53 的唯一手段。有趣 的是，通过敲入丝氨酸 18 基因的小鼠产生变异（丝氨酸到丙氨酸） ， 加速衰老，这表明激活 p53 对 DNA 损伤做出应答来防止衰老（39） 。 已经敲入基因，模拟磷酸化的组成和 p53 的激活的小鼠模型也已经 产生，并展现出惊人的衰老表现型（40） 。这些小鼠的多种器官中大 量的干细胞凋亡，影响正常组织更新。促凋亡 p53 靶 PUMA 的枯竭 导致小鼠的干细胞得以存活，延缓衰老的加速。这表明，控制细胞 凋亡和干细胞的增殖能力，也许才是 p53 基因影响衰老的真正机制。 3.2 乙酰化是调节 p53 活性的一个重要机制。P53 上多种赖氨酸 残基能够被乙酰化；同时许多这种赖氨酸也是泛素相关酶 MDM2 的 目标。因此，这些氨酸残基的乙酰化避免了它们的泛素化，稳定了 p53 活性。而且，乙酰化可以抑制 p53 和 MDM2 之间的相互作用。 乙酰化负责 p53 蛋白的修饰，包括 p300,CBP,PCAF,TIP60,和 hMOF。 在组织培养试验中，乙酰化可以对抗泛素，因此能够稳定 p53 并加 强其活性。在 DNA 结合域的两个乙酰化位点（其中大多数肿瘤相关 的基因突变发生）可能更为重要。被 TIP60 乙酰化的 K120 在激活基 因编码蛋白质中是非常必要的，在细胞凋亡中很重要，但在细胞阻 滞中意义不大。因此，这个位点的修饰对于靶基因对于特定信号应 答的选择是很重要的。相反，K164 的乙酰化对于大多数 p53 的靶基 因的活化是十分必要的。如果 K120 和 K124 连同 6 C-末端赖氨酸都 突变，以至于它们不能被乙酰化，p53 引起细胞周期阻滞或者细胞 凋亡的能力就不能被激活。脱乙酰基酶也作用于 p53 以对抗乙酰基 酶活性。尤其是 SIT1 对 K382 的作用以及对促凋亡基因上 p53 的负 调控作用。白藜芦醇能够激活 SIRT1，在衰老过程中控制 p53 的活性， 这是一种有前途的手段。然而，SITR1 是促进肿瘤还是抑制肿瘤，这 取决于条件，所以必须要小心，以避免 SIRT1 的增强所产生的不利 影响。 3.3 还有其它可以修饰 p53 的方法。在精氨酸和赖氨酸中可以通 过几种不同的甲基化酶使 p53 甲基化，是激活还是抑制 p53 的活性， 主要取决于哪个位点被甲基化和添加甲基基团的数目。在赖氨酸残 基中通过两个泛素类小分子修饰 p53，这个两个小分子是 SUMO（小 泛素类修饰物）和 MEDD8（神经前体细胞表达发育下调蛋白 8） 。目 前为止，这些有关修饰方面的研究比起泛素化的研究还是较少的， 即使他们可以通过实验调节 p53 的活性。仍然要观察这些修饰对衰 老的影响有哪些。 很明显，p53 的活性可以被不同类型的翻译后修饰改变。一个 给定的 p53 蛋白分子的总体活性，取决于任意时间不同数量和不同 修饰的组合。一些修饰可能会影响其它的修饰，尤其是那些针对相 同的 p53 的氨基酸残基。可以通过改变数量，时间和蛋白质修饰的 特异性影响 p53 的活性，进一步影响衰老，这是一个非常有前景的 途径。 4、 P53 和核糖体的合成 核糖体合成是指核糖 RNA 的合成和组装。核糖体蛋白能够多样性表 达和翻译后修饰，所以假设选择性翻译 mRNA 的特定核糖体存在。 而有缺陷的核糖体合成可改变蛋白质的表达，从而引起核糖体病变 （ribosomopathies） 。癌细胞可上调核糖体合成和核糖体蛋白基因的 突变，这意味着上调可能引起癌变。 没有 DNA 损伤的有缺陷的核糖体合成可以稳定 p53。因为核糖体蛋 白（rp）L11，L5 ，L23 和 MDM2 的相互作用，从而稳定 p53。核糖 体应激产生细胞凋亡，这在小鼠中主要取决于其多能造血干细胞的 rpL11 和 p53。此外，癌蛋白 c-Myc 能够稳定 p53，主要通过 rpL11 介导的 HDM2 的抑制和 ASK1/p38 激酶通过丝氨酸 15 和 23 的磷酸化 激活 p53 两方面。然而，稳定 p53 需要 rp5,rpL11,and rp23，而不是 磷酸化的丝氨酸 15。核糖体合成与细胞周期调节相联系，因为 p53 通过 rpL11 来监控 18S 和 28S 的合成。因此，核糖体应激(有或没有 DNA 损伤)可产生 p53 应答。 5、p53 和 mTORC1 人们普遍认为，P53 基因的过度表达导致 G1 期停滞的细胞从静止期 （仍然保留增殖能力）发展到衰老期。但过了 G1 期停滞，p53 基因 就不能诱导细胞衰老，所以它诱导衰老的作用尚不清楚（41） 。P53 在某些条件下其实还可能抑制细胞衰老（42） 。为了证实这种可能性， 在细胞的静止期 p53 基因常过度表达，否则将因为 p21 基因的过度 表达而经历衰老（43） 。此外，雷帕霉素复合物 1（mTORC1 ）的促 增长机制的靶标可能有助于 p21 表达的细胞中诱导衰老（42） 。为了 证实这种可能性，在静止期细胞，mTORC1 的过度表达（通过 TSC2 敲除）引起由 nutlin-3a 介导的生长停滞之后进入衰老（ 44） 。而 mTORC1 的抑制剂雷帕霉素能够逆转这种过程。同理，mTORC1 的负 调控因子 TSC1 维持幼稚 T 细胞处于静止状态（45） 。因此，在诱导 细胞衰老中，p53 基因与 mTORC1 的合作很重要。 mTOR 是磷脂酰肌醇 3-蛋白激酶（PI3K）相关家族中的一个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶（46-49） ，是在一种复合物中（mTOR 复合物 1，mTORC1， ）发现的，这种复合物存在于多种生物中，从酵母到哺 乳动物。mTORC1 调节细胞生长（质量）和增殖（细胞分裂） ，以适 应周围环境。生长因子，如 IGF-1，结合酪氨酸激酶受体，如 IGF- 1R，在细胞膜激活 PI3 蛋白激酶导致 PIP3 的磷酸化（磷脂酰肌醇- 3,4,5-三磷酸） ，是细胞膜上的第二信使。肿瘤抑制因子 PTEN（人第 10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因）通过 PIP3 的去磷 酸化衰减这一通路。PIP3 激活 AKT，AKT 能抑制 TSC1/TSC2（结节性 硬化症） ，这反过来又充当 mTORC1 的一个负调控（50,51） 。已激活 的 mTORC1 上调 mRNA 的翻译，以提高蛋白质合成。mTORC1 直接 磷酸化 S6K1（S6 激酶 1）来诱导核糖体合成和翻译（47,48） 。此外， mTORC1 磷酸化 4E-BPs（elF4E 结合蛋白）终止与 elF4E 的结合。 雷帕霉素与需要 mTORC1 活性（53）的 FKBP12（一种折叠的分子伴 侣）结合，来特异性抑制 mTORC1（52） 。因此，在高营养/能量水 平和低应激的情况下，mTORC1 能够促进细胞生长应答有丝分裂信 号（41） 。雷帕霉素对寿命和非癌症相关的衰老的部分效应是通过间 接减少 p53 的应激反应来实现的。 6、 p53 和糖代谢 葡萄糖是 ATP 生成的主要能量来源,糖酵解能够将葡萄糖转化为丙酮 酸，产生 ATP 和 NADH。丙酮酸再进入三羧酸（TCA）循环通过氧化 磷酸化产生 ATP。跟正常细胞相反，癌细胞主要通过有氧糖酵解生 成能量（ATP） ，以增加合成代谢和延续肿瘤的生长，被称为沃伯格 Warburg 效应（54） 。这些癌症表现为有氧糖酵解和氧化磷酸化受损。 这表明，生成能量方式的变化能导致肿瘤发生。 p53 能够抑制从氧化磷酸化到有氧糖酵解产生 ATP 等代谢的转变 （55） ，这是抑制肿瘤的一个重要方面。 p53 通过多种机制负调控糖 酵解。首先 p53 减少葡萄糖载体的表达（56）并且阻遏胰岛素受体 启动子（57） 。通过控制蛋白质稳定性（ 58） ，反式激活 TP53 诱导的 糖酵解和调节细胞凋亡（TIGAR） （59） ，P53 能够负调控磷酸变位酶 （PGM） ；从而减少糖酵解，转移糖酵解中间产物到戊糖磷酸途径 （PPG） 。P53 还可以抑制碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP ） ， 其能够支持有氧糖酵解（60） 。此外，p53 基因通过细胞色素 c 氧化 酶 2(SCO2)转录靶的合成（61,62）和线粒体凋亡诱导因子蛋白（AIF） （分别对于复合物 IV 和复合物 1 很重要） （ 63，,64）上调有氧呼吸， 促进氧化磷酸化。因此，p53 调节代谢抑制有氧糖酵解和增强氧化 磷酸化。 7、 p53 和热量限制 限制食物摄入量或热量限制（CR）是一种很有特点的干预措施，以 延长各种生物的寿命和改善生理衰老。CR 能够引起跟寿命延长相关 的许多变化（65,66） 。一、有人提出 p53 能够连接 mTORC1 和 SIRT1 来影响细胞的存活以适应 CR（67 ） 。二、白藜芦醇（ 3,5,4-三羟基） 能够激活沉默调节蛋白和 SIRT1（68） ，并且延长高热量饮食小鼠的 寿命（69） ，这表明白藜芦醇可以模拟一些 CR 的有利影响而无需实 际限制卡路里（人为干预的一个好处） 。三、AMPK/p53 抑制 mTORC1 可能是 CR 延长寿命的作用的部分原因。为了适应 CR，p53 基因相关蛋白（p63 和 p73）代替 p53 这种可能性依然存在。另外， 在 CR 中的重要靶点也许就位于 p53 基因的下游。 8、结论 p53 影响细胞代谢和 DNA 的完整性，导致细胞周期阻滞，细胞衰老 和细胞死亡等。虽然在肿瘤抑制中对 p53 的研究比较多，但最近数 据表明，p53 基因也影响衰老。有多种针对 p53 基因的疗法作为抗 癌治疗。而针对 p53 基因抑制衰老表型，很难考虑到细胞阻滞，衰 老和凋亡之间的微妙平衡。当细胞应激时,p53 基因诱导细胞 G1 期 阻滞以保护细胞，但不直接诱导细胞衰老。相反促生长的途径却使 阻滞细胞进入衰老状态。最新数据表明，p53 能够使细胞在丝氨酸 耗尽的情况下存活，具有保护作用（70） 。这些结果意味着特殊和狭 窄的干预措施调节 p53 的活性可能对癌症有效，但对于衰老无效。 相反，广泛的干预措施，减缓生长（雷帕霉素，华润，白藜芦醇） ， 或模拟延缓生长（二甲双胍，AICAR） ，可能会成为改变 P53 在改善 或减缓衰老中的功能的最佳方法。 参考文献： 1.Levine A J. p53, the cellular gatekeeper for growth and divisionJ. cell, 1997, 88(3): 323-331. 2.Shangary S, Wang S. 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