《分子生物学》复习指南

分子生物学复习指南答案 一、名解 1、基因：是含有生物信息的 DNA 片段，根据这些生物信息可 以编码具有生物功能的产物，包括 RNA 和多肽链。( 课件) 2、分子伴侣(Molecular Chaperone)：又称为伴侣蛋白，是一 类在序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质，在细胞 内协助其它多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解，在 功能完成后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组 份。 3、RFLP：即限制性片段长度多态性。高度重复序列中的无间 隔反向重复序列很容易形成限制性内切酶识别位点，也很容易 由于突变产生或失去一个酶切位点，因而可以造成限制性片段 长度多态性。 即用同一种限制性内切酶消化不同个体的同一段 DNA 时， 由于碱基组成的变化而改变限制性内切酶识别位点，从而会产 生长度不同的 DNA 片段，这种方法称为限制性片段长度多态 性，简称 RFLP 技术。 4、DNA 的复制（replication ）：以构成基因组的全套核酸分 子为模板，精确合成一套新的核酸分子的过程。遗传信息通过 亲代 DNA 分子的复制传递给子代，在保持生物物种遗传的稳 定性方面起着重要的作用。 5、反转录：又称逆转录（reverse transcription） ，是以 RNA 为 模板，在逆转录酶的催化下，合成双链 DNA 的反应。 6、克隆载体：可携带插入的外源 DNA 片段并可转入受体细胞 中大量扩增的 DNA 分子。该分子中含有能够在受体细胞中自 主复制的序列和筛选标记，常用于外源基因的克隆，如噬菌体 或质粒。 7、功能基因组：细胞内所有具有生物学功能的基因。 表达一 定功能的全部基因所组成的 DNA 序列，包括编码基因和调控 基因。 8、核不均一 RNA：即 hnRNA,即前体 mRNA，在真核生物中， 最初转录生成的 RNA,存在于真核生物细胞核中的不稳定、大 小不均的一组高分子 RNA 之总称。由外显子和内显子组成， 需经过剪接加工及各种修饰后，形成成熟的 mRNA。 9、分子杂交：由来源不同的两个脱氧核糖核酸单链或核糖核 酸单链结合成双链分子的过程。 确定单链核酸碱基序列的技术，其基本原理是待测单链核 酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可 检出的双螺旋片段。这种技术可在 DNA 与 DNA，RNA 与 RNA，或 DNA 与 RNA 之间进行，形成 DNA-DNA，RNA- RNA 或 RNA-DNA 等不同类型的杂交分子。 10、RNA 编辑：是 RNA 加工的一种特殊方式，是通过对 mRNA 的加工使遗传信息在 mRNA 水平上发生改变。有少数 真核基因转录后产生的成熟 mRNA 序列与相应基因的编码序 列有差异，这些差异是在转录物上增加、删除或取代某些核苷 酸后形成的，这种编辑后的 mRNA 才是有翻译功能的 mRNA 分子。 11、操纵子：原核生物基因多以操纵子（operon）的形式存 在。操纵子由调控区和信息区组成，上游是调控区，包括 启动子（promoter）与操纵元件（ operator）二部分。操纵 元件：特异的阻遏物结合区。 12、启动子：是 RNA 聚合酶结合位点及其周围的一组转录 调控组件（包括转录起始点以及典型的 TATA 盒） 。 二、填空 转基因动物：是指用 DNA 重组技术将外源基因导入动物基 因组内，使之能在体内表达并稳定地遗传给后代的一类动 物。 端粒酶组成：蛋白质和 RNA 共同组成，能以自身的 RNA 为模板反复延伸端丽 DNA 的重复序列。 载体类型：克隆载体和表达载体（书上） 常用载体：DNA 克隆常用的载体有：质粒载体 （plasmid） ，噬菌体载体（phage ） ，柯斯质粒载体 （cosimid） ，单链 DNA 噬菌体载体（ssDNA phage ） ，噬 粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。从总 体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体， 表达载体，测序载体，穿梭载体等。 基因敲除定义：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去 活性的方法。常用同源重组的方法敲除目的基因，观察生 物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。 PCR 种类 ：RT-PCR,定量 RT-PCR，实时荧光定量 RT- PCR，反向 PCR，Alu-PCR，原位 PCR，巢式 PCR，不对 称 PCR，固相锚定 PCR，长片段 PCR，多重 PCR。 基因打靶技术：基因打靶通常是指用含已知序列的 DNA 片段 与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整 合至受体细胞基因组中并得以表达的一种改变生物活体遗传信 息的外源 DNA 导入技术。 假基因定义：在多基因家族中某些与正常功能基因在核酸序列 上相似，但不能转录或转录之后生成无功能基因产物的 DNA 序列被称为假基因,用 表示。 基因治疗定义：基因治疗是指将目的基因导入靶细胞内，成为 宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因表达产物对疾病起治疗 作用。 转录因子类型（狭义）：指通过基因转移技术或反义核酸技术、 核酶技术等，使目的基因在体内得到表达，或封闭、剪切致病 基因的 mRNA，从而达到治疗疾病的目的（广义） 。生殖细胞 基因治疗、体细胞基因治疗 自杀基因：是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表 达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携 带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为自杀基因。 RT-PCR 原理：RT-PCR 为反转录 RCR（reverse transcription PCR）和实时 PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录 PCR，或者称反转录 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)， 是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中， 一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进 行 DNA 扩增。 DNA 变性：在某些理化因素（温度、PH、离子强度等）的作用下， DNA 双链的互补碱基对之间的氢键断裂，使 DNA 双螺旋结构松散， 成为单链的现象极为 DNA 变性。只改变其二级结构，不改变他的 核苷酸序列。 蛋白质分子翻译后的化学修饰方式：糖基化、羟基化、甲基化、磷 酸化、二硫键形成、亲脂性修饰 .翻译后蛋白质需要进行不同形式的共价修饰，包括肽链 N 端甲硫 氨酸残基的切除，蛋白质前体的酶切修饰，氨基酸残基侧链基团的 磷酸化去磷酸化、乙酰化去乙酰化等。翻译后蛋白质与糖链共 价结合成糖蛋白，称糖基化修饰，包括 N-糖基化和 O-糖基化。膜 蛋白经过豆蔻酰化和棕榈酰化等脂酰化修饰才能定位于膜。有的蛋 白质翻译后由两个半胱氨酸残基上的巯基氧化形成二硫键，使蛋白 质的立体结构更稳定。也有蛋白质需要与金属离子结合转变为功能 蛋白质。 Western blotting 定义：是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进 行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新 基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 疾病分子机制研究策略： 基因表达调控方式类型:1、原核生物：转录水平调控（启动子、S 因子、阻遏蛋白、正调控蛋白） 、翻译水平调控（SD 序列、mRNA 的稳定性及翻译产物的调控作用）2、真核生物：DNA 水平（染色 质丢失、基因扩增、基因重排、DNA 甲基化、染色质结构改变） 、 转录水平（反式作用因子） 原核生物基因表达的调控主要为（1）转录水平上的调控（2）转录 后水平上的调控 mRNA 加工成熟水平上的调控 翻译水平上 的调控 主要调控机制为操纵子 真核生物基因表达调控的环节：DNA 水平的调控，转录水平的调 控，转录后水平的调控，翻译水平的调控，翻译后水平的调控（见 P62 和第八章） 管家基因：有些基因产物对生命全过程都是必须的或必不可少的。 这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为 管家基因。 顺式作用元件：就是指可影响自身基因表达活性的 DNA 序列 PCR-ELISA 分析:即在 PCR 扩增以后，在微也板上借用酶联免疫 吸附试验（ELISA ）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现 定量。被称为 PCRELISA： 反式作用因子：真核细胞内含有大量的序列特异性的 DNA 结合蛋 白，其中一些蛋白的主要功能是使基因开放或关闭，称为反式作用 因子，简称反式因子。也称为基因特异性转录因子，是一类细胞核 内蛋白质因子。 原核细胞 DNA 的甲基化位点： 三、选择题 真核细胞参与基因表达调节的调控区比原核细胞复杂原因：多 级调控 在真核基因表达的调控中，上游调控元件（UCE）能促进转录 的速率 基因突变类型:点突变、移码突变、缺失突变、插入突变（按碱 基变化情况分）同义突变、错义突变、无义突变（按影响分） 溴化乙锭是一种 _ 试剂：高灵敏度的荧光染色剂，常用于 观察 PAGE 或琼脂糖凝胶中的核酸；合成 DNA 及 RNA 的抑 制剂及诱变剂；分离和测定核酸结构（网上搜的，仅供参考） Dicer 蛋白是 :Dicer 是 RNA 干扰中起核心作用的一种 dsRNase。 （网上搜的，仅供参考） 蛋白质芯片技术原理：以偶联标记物的抗体分子作为探针，检 测转移到固相支持物上的蛋白质分子 基因治疗靶细胞类型:生殖细胞、体细胞 基因诊断技术类型：核酸分子杂交、PCR 技术、 DNA 序列测 定、DNA 芯片技术 真核生物基因的顺式作用元件类型：启动子和上游启动子元件， 增强子，反应元件和 poly（A)加尾信号 原核基因基因组结构特点：基因密度高，基因组序列中编码区 所占比例较大；重复序列很少；含有同工酶的同基因；不同原 核生物基因组中的 GC 含量变化很大。 受体作用的特点：高度特异性、高亲和力、可饱和性和可逆性。 12、DNA 指纹：DNA 经限制酶酶切后，以重复序列中的核心 序列为探针进行 DNA 印迹杂交所形成的杂交带型。 13、分子伴侣特点：分子伴侣又称伴侣蛋白，是一类序列上没 有相关性但有共同功能的保守性蛋白质，它们在细胞内能协助 其他多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解。分子伴侣 本身不包括控制正确折叠所需的构象信息，但是能阻止非天然 态多肽链的错误折叠或凝集，给处于折叠中间态的多肽链提供 更多的正确折叠的机会，因而它们能提高折叠的产率但不一定 能提高其速度。 目前已发现细胞内至少有两类伴侣蛋白家族， 即热休克蛋白家族和伴侣素。 14、反式作用因子的激活方式：通过基因表达产生反式作用因 子、共价修饰调节蛋白的活性、与配体结合引起功能变化、蛋 白质与蛋白质相互作用。 15、真核细胞转染的方法：磷酸钙共沉淀法介导基因转染、 电钻孔法介导基因转染、DEAE-葡萄糖法介导基因转染、 脂质体介导基因转染、显微注射法。 16、真核转录调控作用主要环节：反式作用因子通过结合 顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成。 17、功能基因组学研究的内容是：基因组的表达、蛋白质 产物的功能、基因组多样性的研究、基因组功能注释等。 18、限制性内切酶切割特点：能识别双链 DNA 分子内部的 特异位点并且裂解磷酸二酯键 19、转基因方法： 基因转移的生物学方法是以病毒载体作为基因转移系统 基因转移的非生物学方法是利用各种非病毒介质作为基因 转移系统，如：脂质体介导基因转移、细胞表面受体介导 基因转移、直接注射介导基因转移、其他。 20、蛋白质生物合成肽链的方向是 : 21、基因工程使用的工具酶有哪些：限制性核酸内切酶、 DNA 多聚酶、逆转录酶、DNA 连接酶等。 22、真核生物的 mRNA 帽子结构特点：甲基化鸟苷酸以 5 磷酸基团连接 mRNA5端形成帽子结构，有 型帽子结构 和型帽子结构。 23、DNA 损伤修复方式： 原核细胞：直接修复、切除修复、重组修复、SOS 修复 真核细胞：细胞周期检查点控制 24、克隆载体类型：常见克隆载体主要来自质粒和病毒 25、DNA 损伤的方式：交联、断裂、碱基突变、DNA 重组 四、判断题 1.分子生物学是研究对象：核酸、蛋白质等所有生物大分子 的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学， 2.点突变：也称作单碱基替换，指由于 DNA 复制过程中的 自发突变或由于物理、化学原因导致的单碱基改变发生的 突变，可以分为转换和颠换 3.基因定点诱变 （Site-directed mutagenesis） ，是在体外特 异性地取代、插入或缺失 DNA 序列中任何一个特定碱基的 技术,包括盒式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及 PCR 定点诱 变等。在 DNA 水平上产生多肽编码顺序的特异性改变称为 基因的定向诱变。 4. 基因诊断：主要是应用分子生物学技术，检测人体某些 基因结构或表达的变化，或者检测病原体基因组在人体内 的存在，从而达到诊断疾病或监控疾病治疗效果的目的。 将分子生物学技术用于诊断疾病，可能达到前所未有的特 异性强，灵敏度高，简便快速的目的。基因诊断将成为疾 病诊断的一个重要方面，也将成为法医学的一个重要手段。 5.反义 RNA 和 siRNA： 反义 RNA：与靶核酸(如 mRNA 或有义 DNA)链互补的 RNA 分 子，可抑制靶核酸的功能，导致正常翻译终止的 RNA 分子。 根据反义 RNA 的作用机制可将其分为 3 类：类反义 RNA 直 接作用于靶 mRNA 的 S D 序列和(或)部分编码区，直接抑制翻 译，或与靶 mRNA 结合形成双链 RNA，从而易被 RNA 酶 降解；类反义 RNA 与 mRNA 的非编码区结合，引起 mRNA 构象变化，抑制翻译；类反义 RNA 则直接抑制靶 mRNA 的 转录。反义 RNA 是指与 mRNA 互补的 RNA 分子，也包括与 其它 RNA 互补的 RNA 分子。由于核 糖 体 不能翻译 双 链 的 RNA，所以反义 RNA 与 mRNA 特异性的互补结合, 即抑制了 该 mRNA 的翻 译 。通过反义 RNA 控制 mRNA 的翻译是原 核 生 物 基因表达调控的一种方式。 siRNA：小干扰 RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时 称为短干扰 RNA（short interfering RNA）或沉默 RNA（silencing RNA） ，是一个长20到25个核苷酸的双股 RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知 siRNA 主要参 与 RNA 干扰（RNAi ）现象，以带有专一性的方式调节基因的 表达。此外，也参与一些与 RNAi 相关的反应途径，例如抗病 毒机制或是染色质结构的改变。是一种小 RNA 分子（21-25核 苷酸） ，由 Dicer（RNAase 家族中对双链 RNA 具有特异性的 酶）加工而成。SiRNA 是 siRISC 的主要成员，激发与之互补 的目标 mRNA 的沉默。 siRNA 有如下特点： 1. 长度约在 22nt 左右。 2. 依 赖 Dicer 酶的加工，是 Dicer 的产物，所以具有 Dicer 产物的特 点。 3. 生成需要 Argonaute 家族蛋白存在。 4. 是 RISC 组分。 5. siRNA 合成是由双链的 RNA 或 RNA 前体 形成的。 6. siRNA 一般是人工体外合成的，通过转染进 入人体内，是 RNA 干涉的中间产物；植物体内也存在内源的 siRNA。 7. 结构上， siRNA 是双链 RNA。 8. 在 Dicer 酶的加工过程中， siRNA 对称地来源于双链 RNA 的前 体的两侧臂。 9. 在作用位置上， siRNA 可作用于 mRNA 的任何部位，并与 mRNA 完全互补。 10. 在作用方式上， siRNA 只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。 11. siRNA 不参与生物生长，是 RNAi 的产物，原始作用是抑制 转座子活性和病毒感染。 6.Northern blot Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达 水平来检测基因表达的方法，通过 northern blot 的方法可以检 测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因 表达情况。 指的是 RNA 分子从胶上转移到膜上的过程，当然 它现在通指整个实验的过程。Northern blot 可用来检测不同组 织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特 定基因的表达样式。Northern blot 还可用来检测目的基因是否 具有可变剪切产物或者重复序列。 Northern blot 首先通过电 泳的方法将不同的 RNA 分子依据其分子量大小加以区分，然 后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。 Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有 可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经 过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。 Western blot 称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学 和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过 特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。 通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细 胞或组织中的表达情况的信息。Western Blot 采用的是聚丙烯 酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质， “探针” 是抗体， “显色”用标 记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋 白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反 应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或 放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 7 反式作用因子 通过直接结合或间接作用于 DNA、RNA 等 核酸分子，对基因表达发挥不同调节作用(激活或抑制 )的各类 蛋白质因子； 起反式作用的调控元件；其本身对基因表达没 有调控作用，只是阻断来自上、下游的调控效应；是指能直接 或间接地识别或结合在各类顺 式 作 用 元 件 核心序列上参与调 控靶基因转录效率的蛋白质。 （大多数真核转录调节因子由某 一基因表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作 用，从而激活另一基因的转录。这种调节蛋白称反 式 作 用 因 子 。 ） 反式作用因子有两个重要的功能结 构 域 :DNA 结合结构 域和转录活化结构域,它们是其发挥转录调控功能的必需结构， 此外还包含有连接区。反式作用因子可被诱导合成, 其活性也 受多种因素的调节。 同一类序列特异性的反式作用因子由 多基因家族所编码, 它们具有特定的蛋 白 质 结 构 (如上述的锌 指 结 构 、碱性亮氨酸拉链、 螺 旋 -环 -螺 旋 基 元 等)和蛋白质结 构上的同源性, 因而构成反式作用因子家族, 如类 固 醇 激 素 受 体 家族、AP1 家族等。 主要包括： 1.DNA 结合域： a.螺旋-转角-螺旋 b.锌指结构 c.亮氨酸拉链 d.螺 旋-突环- 螺旋 8.RT-PCR 技术 即逆转录 PCR，是将 RNA 的逆转录（RT） 和 cDNA 的聚合酶链式扩增反应（ PCR）相结合的技术。 RT- PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表 达水平，细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。 首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA，再以 cDNA 为 模板，扩增合成目的片段。作为模板的 RNA 可以是总 RNA、 mRNA 或体外转录的 RNA 产物。无论使用何种 RNA，关键是确保 RNA 中无 RNA 酶和基因组 DNA 的污染。 RT- PCR 操 作 流 程 ： 1.从细胞或特定组织中提取总 RNA； 2.逆转录实验； 3.扩增内参和目的基因并比较基因表 达差异。 RT-PCR 影 响 因 素 ： RT-PCR 反应受多个因素影响，如硫 酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。 建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。 对于具有较高 Tm 的引物，增加退火和延伸时的温度对 反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因 而提高特异产物的得率。 大多数目标 RNA 经40轮 PCR 反应就能观察到。但如果目标 RNA 太稀少，或者只有 很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。 9 核酶：具有生物催化功能的 RNA，是生物催化剂。又称 核酸类酶，酶 RNA,核酶类酶 RNA。它的发现打破了酶是 蛋白质的传统观念。 10表达载体：能使插入基因进入宿主细胞表达的克隆载体， 包括原核表达载体和真核表达载体，可以是质粒、噬菌体 或病毒。典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列， 并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切酶位点。 11蛋白质分子模体： 模体(motif) 属于蛋白质的超二级结构， 由2个或2个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近， 形成一个特殊的空间构象，并发挥专一的功能。一种类型 的模体总有其特征性的氨基酸序列。 12 提高 PCR 扩增产物特异性方法 1 递减 PCR 通过在 PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。2 热 启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最 重要的方法之一。 3 促进 PCR 的添加剂退火温度，引物 设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性 的扩增，但是，某些模板，包括高 GC 含量的模板，需要 其他的措施。影响 DNA 熔解温度的添加剂提供了提高产 物特异性和产量的另外一种方法。 4. 巢式 PCR 使用巢式 引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度 五、简答题 1.基因结构与表达分析策略 DNA 序列分析: a.双脱氧链末端终止法 b.化学降解法 c. DNA 序列分析自动化 核酸分子杂交:Southern、Northern、斑点杂交、原位杂交、 液相杂交 聚合酶链反应 基因芯片与微阵列 Western 免疫印迹 其它技术 2.基因克隆的基本过程 一 目 的 DNA 片 段 的 获 得 二 载 体 的 选 择 三 体 外 重 组 四 导 入 受 体 细 胞 五 重 组 子 的 筛 选 常 用 载 体 ： DNA 克 隆 常 用 的 载 体 有 ： 质 粒 载 体 （ plasmid） ， 噬 菌 体 载 体 （ phage） ， 柯 斯 质 粒 载 体 （ cosimid） ， 单 链 DNA 噬 菌 体 载 体 （ ssDNA phage ） ， 噬 粒 载 体 （ phagemid） 及 酵 母 人 工 染 色 体 （ YAC） 等 。 从 总 体 上 讲 ， 根 据 载 体 的 使 用 目 的 ， 载 体 可 以 分 为 克 隆 载 体 ， 表 达 载 体 ， 测 序 载 体 ， 穿 梭 载 体 等 。 常 用 工 具 酶 ： 限 制 性 内 切 酶 DNA 分 子 的 特 异 切 割 。 DNA 甲 基 化 酶 DNA 分 子 的 甲 基 化 。 核 酸 酶 DNA 和 RNA 的 非 特 异 切 割 。 核 酸 聚 合 酶 DNA 和 RNA 的 合 成 。 核 酸 连 接 酶 DNA 和 RNA 的 的 链 接 。 核 酸 末 端 修 饰 酶 DNA 和 RNA 的 末 端 修 饰 。 其 它 破 壁 ， 转 化 ， 检 测 用 酶 。 3.电子克隆原理与方法 原理：电子克隆（ in silico cloning）是近年来伴随着基因组 和 EST 计划发展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用 日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力， 通过 EST 或基因组的序列组装和拼接，利用 RT-PCR 的方法快速 获得功能基因。 基于原理：物种同源蛋白氨基酸序列相似性 （保守性） 方法：从 GenBank 的 核 酸 （ nr） 数 据 库 中 检 索 已 测 序 列 植 物 的 目 的 基 因 ， 获 得 目 的 基 因 cDNA 序 列 ， 以 该 序 列 为 模 板 对 另 一 种 未 测 序 列 植 物 EST 数 据 库 进 行 BLAST 检 索 ， 获 得 与 之 部 分 同 源 的 EST 群 ， 从 中 选 取 一 条 EST 作 为 种 子 序 列 BLAST 检 索 该 植 物 的 EST 数 据 库 ， 将 检 出 与 种 子 序 列 同 源 性 较 高 或 有 部 分 重 叠 的 EST 序 列 拼 接 组 装 为 重 叠 群 （ contig） ， 再 以 此 重 叠 群 序 列 重 复 以 上 BLAST 检 索 过 程 ， 反 复 进 行 EST 重 叠 群 序 列 的 拼 接 和 比 对 ， 直 至 检 出 所 有 的 重 叠 EST 或 重 叠 群 不 能 继 续 延 伸 ， 最 终 获 得 未 测 序 列 植 物 基 因 的 cDNA 全 序 列 。 4.PCR 的原理与方法 原理：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应， 是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与 母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。是一项 DNA 体外合成 放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的 DNA.可用于基 因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等 许多方面。 PCR 反应基本步骤： 1、变性：高温使双链 DNA 解离形成单链（94，30s）。2、退 火：低温下，引物与模板 DNA 互补区结合（55，30s）。3、 延伸：中温延伸。DNA 聚合酶催化以引物为起始点的 DNA 链延 伸反应（7072，3060s）以上述三个步骤为一个循环， 每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过 n 次循环后， 目的 DNA 以 2n 的形式增加。 5.转基因动物检测方法 一 染色体和基因水平：1 DNA 斑点杂交 2 PCR 技术 3 Southern 印迹法 4 染色体原位杂交 二 转录水平：可采用 Northern 印迹法、RT - PCR、RNase 保护分析等 三 翻译水平：Western 印迹杂交或者免疫组织化学分析方法 6.真核生物基因表达调控的主要环节 1DNA 水平调控：基因丢失、基因扩增、基因重排、DNA 的甲 基化与基因调控、染色质结构与基因表达调控。 2.转录水平调控：转录起始复合物的形成，顺式作用原件，反 作用因子，转录水平的调控机制。 3. 转录后水平调控：5端加帽和 3端多聚腺苷酸化及其调 控，前体 mRNA 的选择性剪接。 4.翻译水平调控:翻译起始的调节, mRNA 稳定性调节，小分子 RNA 对翻译的调控作用。 5.蛋白质加工水平的调控： 7.基因诊断技术路线与方法 路线：1 直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接 诊断途径 2 利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的 间断诊断途径 方法：核酸分子杂交.聚合酶链反应(PCR).单链构象多态性 检测(SSCP).限制性片段长度多态性(RFLP)分析法 .DNA 序列 测定.DNA 芯片技术。 六、分析论述题 基因治疗 概念： 狭义理解：指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生 整合，成为宿主基因组的一部分，目的基因的表达产物起治 疗疾病的作用。 基本概念：用正常或野生型基因置换致病基因以纠正基因结 构和功能异常的一种治疗疾病的方法。 广义理解：指通过基因转移技术或反义核酸技术、核酶技术等， 使目的基因在体内得到表达，或封闭、剪切致病基因的 mRNA，从而达到治疗疾病的目的。 基因治疗的种类或途径 1.生殖细胞基因治疗 2.体细胞基因治 疗 基 因 治 疗 的 现 状 ： 肿 瘤 的 基 因 治 疗 ， 艾 滋 病 的 基 因 治 疗 ， 遗 传 病 的 基 因 治 疗 基 因 治 疗 的 策 略 1.基 因 替 代 ： 去 除 整 个 变 异 基 因 ， 用 有 功 能 的 正 常 基 因 取 而 代 之 ， 使 致 病 基 因 得 到 永 久 的 更 正 。 2.基 因 修 正 ： 将 致 病 基 因 的 突 变 碱 基 序 列 纠 正 ， 而 正 常 部 分 予 以 保 留 。 3.基 因 增 强 ： 将 目 的 基 因 导 入 病 变 细 胞 或 其 它 细 胞 ， 目 的 基 因 的 表 达 产 物 可 以 补 偿 缺 陷 细 胞 的 功 能 或 使 原 有 的 功 能 得 到 加 强 。 4.基 因 抑 制 或 基 因 失 活 ： 通 过 导 入 外 源 基 因 去 干 扰 、 抑 制 或 破 坏 有 害 或 异 常 基 因 的 表 达 。 基 因 治 疗 的 适 应 症 或 基 本 条 件 1.该 遗 传 病 有 一 定 发 病 率 ,且 危 害 严 重 ,现 行 各 种 疗 法 、 手 段 无 效 或 疗 效 不 佳 。 2.已 经 在 DNA 水 平 上 明 确 其 发 病 机 理 。 3.相 关 基 因 已 被 分 离 、 克 隆 并 了 解 清 楚 。 4.导 入 的 基 因 只 需 低 水 平 表 达 即 可 治 愈 疾 病 或 改 善 病 情 。 5.导 入 基 因 (外 源 基 因 )表 达 水 平 不 需 严 格 控 制 。 6.该 基 因 可 在 体 外 进 行 操 作 ， 且 已 在 体 外 培 养 和 动 物 实 验 等 方 面 获 得 成 功 ， 可 靠 性 好 ， 安 全 性 高 。 基 因 治 疗 的 步 骤 1.目 的 基 因 的 选 择 和 制 备 ： 人 体 正 常 基 因 (基 因 组 DNA、 cDNA)或 非 人 体 基 因 。 获 取 方 法 ： 人 工 合 成 (DNA 化 学 合 成 )、 基 因 克 隆 或 聚 合 酶 链 反 应 。 2.选 择 并 培 养 受 体 细 胞 (靶 细 胞 ) 3.选 择 并 准 备 适 当 的 载 体 质 粒 载 体 病 毒 载 体 4.目 的 基 因 与 载 体 连 接 并 筛 选 鉴 定 5.将 重 组 体 导 入 靶 细 胞 ,并 对 转 染 细 胞 进 行 选 择 、 鉴 定 6.效 果 考 核 目 的 基 因 (标 志 基 因 )表 达 情 况 临 床 症 状 、 病 情 改 善 情 况 基 因 治 疗 的 临 床 实 践 1.遗 传 性 疾 病 的 治 疗 (1) 地 中 海 贫 血 (2)血 友 病 2 肿 瘤 的 基 因 治 疗 3、 心 血 管 病 的 基 因 治 疗 基 因 治 疗 的 展 望 几 个 问 题 ： 基 因 导 入 系 统 ； 基 因 表 达 的 可 控 性 及 更 多 更 好 的 治 疗 基 因 。 1.高 效 的 、 靶 向 性 基 因 导 入 系 统 基 因 治 疗 中 的 关 键 问 题 是 能 将 治 疗 基 因 输 送 到 特 定 靶 细 胞 ， 并 能 在 该 细 胞 中 得 到 高 效 表 达 。 2.外 源 基 因 表 达 的 可 控 性 最 理